Приготовление мазков

Для изучения микроорганизмов в окрашенном виде на предметном стекле делают мазок, высушивают, фиксируют его и после этого окрашивают.

Исследуемый материал распределя­ют тонким слоем по поверхности хорошо обез­жиренного предметного стекла.

Мазки готовят из культур микробов, патологического ма­териала (мокрота, гной, моча, кровь и др.) и из органов трупов.

Техника приготовления мазков определяется характером исследуемого материала.

Приготовление мазков из микробных культур с жидкой питательной средой и из жид­кого патологического материала (моча, ликвор и др.). Маленькую каплю исследуемой жидкости на­носят бактериальной петлей на предметное стекло и круго­выми движениями петли распределяют равномерным слоем в виде кружка диаметром в копеечную монету.

Приготовление мазков из крови. На пред­метное стекло, ближе к одному из его концов, наносят кап­лю крови. Второе — шлифованное — стекло, которое должно быть уже предметного, ставят на первое под углом 45° и подводят к капле крови до соприкосновения с ней. После того как кровь растечется по шлифованному краю, стеклом делают скользящее движение справа налево, равномерно рас­пределяя кровь тонким слоем по всей поверхности стекла. Толщина мазка зависит от величины угла между стеклами: чем острее угол, тем тоньше мазок. Правильно приготовленный мазок имеет светло-розовую окраску и оди­наковую толщину на всем протяжении.

Приготовление толстой капли. На середину предметного стекла пастеровской пипеткой наносят каплю крови или прикладывают стекло непосредственно к выступающей капле крови. Нанесенную на стекло кровь размазывают бактериальной петлей так, чтобы диаметр об­разующегося мазка соответствовал величине копеечной мо­неты. Стекло оставляют в горизонтальном положении до высыхания крови. Кровь в «толстой капле» распределяется неравномерно, образуя неровный край.

Приготовление мазка из вязкого мате­риала (мокрота, гной). Мокроту или гной, нанесенные на предметное стекло ближе к узкому краю, накрывают другим предметным стеклом. Стекла слегка придавливают друг другу.

После этого свободные концы стекол захватывают 1 и 2 пальцами обеих рук и разводят в противоположные стороны так, чтобы при движении оба стекла плотно прилегали друг к другу. Получаются мазки с равномерно распределенным материалом, занимающим большую площадь.

Приготовление мазка из культур с плотных питательных сред. На середину чистого, хорошо обезжиренного предметного стекла наносят каплю воды, в нее вносят бактериальную петлю с небольшим количеством исследуемой микробной культуры, так, чтобы капля жидко­сти стала слегка мутноватой. После этого излишек микроб­ного материала на петле сжигают в пламени и при­ступают к приготовлению мазка по вышеописанному способу.

Приготовление мазков из органов и тканей. Поверхность органа с целью обеззараживания прижигают накаленными браншами пинцета, делают по этому ме­сту надрез и из глубины остроконечными ножницами вырезают небольшой кусочек ткани, который помещают между двумя предметными стеклами. Далее поступают так же, как при приготовлении мазка из гноя и мокроты. Если ткань органа плотная, то из глубины разреза делают скальпелем соскоб. Полученный при соскабливании материал распределя­ют тонким слоем по поверхности стекла скальпелем или бактериальной петлей.

Для изучения взаимного расположения элементов ткани и находящихся в ней микроорганизмов делают мазки-отпе­чатки. Для этого вырезанный из середины органа небольшой кусочек ткани захватывают пинцетом и прикладывают по­следовательно несколько раз по­верхностью среза к предметному стеклу, получая, таким образом, ряд мазков-отпе­чатков.

Высушивание и фиксация мазков. Приготовленный на предметном стекле мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.

Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение средств, вызывающих коагуляцию белков. Нельзя фиксировать над пламенем мазки, содержащие возбудителей I–IIгрупп патогенности.

Физический способ фиксации. Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за ребра мазком кверху и плавным движением проводят 2—3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с. Надежность фиксации проверяют следующим простым приемом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикла­дывают к тыльной поверхности левой кисти. При правиль­ном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога.

Механизм и этапы окраски по Граму.

1. На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 1-2 мин снять ее, а краситель слить.

2. Нанести раствор люголя на 1-2 мин (йод)

3. Обесцветить этиловым спиртом в течении 30-60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4. Промыть водой

5. Докрасить водным р-ом фуксина в течении 1-2 мин, промыть водой, высушить и микроскопировать.

* Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные - в красный

17. Простые и сложные методы окраски, их применение (по Граму, Ожешко, Циль- Нильсену, Бурри-Гинсу, Нейссеру и др.)

Окраску мазка производят простыми или сложными методами. Простые за­ключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю — Нильсену и др.) включают последо­вательное использование нескольких красителей и имеют диффе­ренциально-диагностическое значение. Отношение микроорганиз­мов к красителям расценивают как тинкториальные свойства.

Метод Грама: Цель применения Для отличия одних видов бактерий от других (грамположительных от грамотрицательных), что является важным таксономическим признаком

Этапы окраски 1. На фиксированный мазок поместить фильтр.бумажку, пропитанную генцианвиолетом, смочить её водой, выдержать 3 минуты

2. Снять бумажку, слить с препарата оставшуюся краску и налить р-р Люголя на 1 минуту.

3. Слить р-р Люголя, провести дифференциацию, погрузив препарат несколько раз в стаканчик со спиртом (пока не перестанут отходить фиолетовые струйки)

4. Тщательно промыть препарат водой

5. Дополнительно подкрасить препарат с помощью красящей бумажки, пропитанной р-ром карболового фуксина, в течение 3 минут.

6. Промыть водой, высушить.

Сущность метода При окраске генцианвиолетом и последующем воздействии раствором Люголя образуется комплексное соединение краски с йодом, которое при дифференциации спиртом удерживается в клетках грамположительных (они остаются фиолетовыми) и удаляются из грамотрицательных (при дополнительной окраске фуксином приобретают красный цвет). Способность бактерий удерживать комплекс генцианвиолета с йодом зависит, главным образом, от строения клеточной стенки, имеющей существенные различия у грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Результат: описание микроскопической картины В поле зрения видны стафилококки сине-фиолетового цвета – грамположительные – и расположенные между ними кишечные палочки, имеющие красный цвет, т.е. грамотрицательные.

Метод Бурри-Гинса:Цель применения Для выявления капсул у чистых культур капсульных бактерий

Этапы окраски 1. На предметное стекло нанести рядом каплю туши и каплю воды, в которой суспензировать внесённую петлёй капсульную культуру

2. Обе капли соединить в одну и размазать её тонким слоем с помощью второго предметного стекла

3. Высохший на воздухе мазок осторожно фиксировать в пламени горелки

4. Докрасить препарат разведённым карболовым фуксином Циля в течение 2-3 мин, после чего промыть водой и высушить.

Сущность метода Фуксин окрашивает тела бактерий в красный цвет, капсулы остаются неокрашенными.

Результат: описание микроскопической картины В поле зрения видны бациллы красного цвета, окруженные белыми ореолами капсул, которые хорошо видны на серовато-коричневом тушевом фоне.

Метод Циля-Нельсона:Цель применения Для дифференцирования кислотоустойчивых бактерий от некислотоустойчивых, к которым относятся подавляющее число микроорганизмов.

Этапы окраски 1. Окрасить мазок карболовым фуксином при подогревании (три раза до появления паров – примерно 3 минуты)

2. Промыть водой

3. Обесцветить препарат 5% H2SO4

4. Промыть водой

5. Докрасить мазок контрастной краской – метиленовым синим (5 минут)

6. Промыть водой. Высушить.

Сущность метода Кислотоустойчивость зависит от наличия в клеточной стенке липидов, воска и особенно миколовой кислоты. Кислотоустойчивые бактерии требуют интенсивной окраски (конц. фуксином Циля при нагревании), они прочно удерживают краситель, не обесцвечиваются серной кислотой и остаются рубиново-красными. Некислотоустойчивые при дифференцировке серной кислотой обесцвечиваются и докрашиваются метиленовым синим.

Результат: описание микроскопической картины В поле зрения видны небольшие палочки рубиново-красного цвета (Mycobacteriumtuberculosis) и окрасившиеся в дополнительный синий цвет некислотоустойчивые стафилококки.

Метод Нейссера:Цель применения Для выявления цитоплазматических включений валютина

Этапы окраски 1. Мазок окрашивают уксусной синькой (1мин)

2. Промывают водой

3. Докрашивают везувином 20-30 сек

4. Промывают водой

Сущность метода

Результат: описание микроскопической картины В поле зрения видны бактерии, тела которогых светло-коричневого цвета, зёрна валютина, расположенные на обоих концах бактерий, окрашены в сине-чёрный цвет.

Метод Ожешке:Цель применения Для окраски спор бактерий

Этапы окраски 1. На нефиксированный мазок 0,5% раствор HClи подогревают 2 мин.

2. Промывают, высушивают и фиксируют

3. Докрашивают по методу Циля – Нильсена

Сущность метода Основан на кислотоустойсивости бактерий.

Результат: описание микроскопической картины В поле зрения видны рубиново-красные споры, вегетативные клетки голубого цвета

18. Ядерный аппарат микробной клетки. Особенности его строения у эукариот и прокариот.

Нуклеоид — эквивалент ядра у бактерий. Он расположен в центральной зоне бактерий в виде двунитевой ДНК, замкнутой в кольцо и плотно уложенной наподобие клубка.

Ядро бактерий, в отличие от эукариот, не имеет ядерной оболочки, ядрышка и основных белков (гистонов). Обычно в бактериальной клетке содержится одна хромосома, представленная замкнутой в кольцо молекулой ДНК.

Кроме нуклеоида, представленного одной хромосомой, в бактериальной клетке имеются внехромосомные факторы наследственности - плазмиды, представляющие собой ковалентно замкнутые кольца ДНК.

Нуклеотиды прокариот: общие сведения

Строение генетического аппарата прокариот долгое время было предметом жарких дискуссий, суть которых сводилась к тому, есть у них такое же ядро, как у эукариот , или нет. Установлено, что генетический материал прокариотных организмов, как и эукариотных, представлен ДНК , но имеются существенные различия в его структурной организации. У прокариот ДНК представляет собой более или менее компактное образование, занимающее определенную область в цитоплазме и не отделенное от нее мембраной, как это имеет место у эукариот.

Чтобы подчеркнуть структурные различия в генетическом аппарате прокариотных и эукариотных клеток, предложено у первых его называть нуклеоидом в отличие от ядра у вторых.

При электронно-микроскопическом наблюдении видно, что нуклеоид прокариот, несмотря на отсутствие ядерной мембраны, довольно четко отграничен от цитоплазмы, занимает в ней, как правило, центральную область и заполнен нитями ДНК диаметром около 2 нм. Не исключено, что на выявляемую в электронном микроскопе организацию прокариотной хромосомы большое влияние оказывают условия фиксации препарата. По имеющимся наблюдениям, в живой клетке нуклеоид занимает больше места в цитоплазме.

Вся генетическая информация прокариот содержится в одной молекуле ДНК, имеющей форму ковалентно замкнутого кольца и получившей название бактериальной хромосомы . (В прокариотной клетке ДНК может находиться и вне бактериальной хромосомы - в плазмидах , но последние не являются обязательными клеточными компонентами).

Длина молекулы ДНК в развернутом виде может составлять более 1 мм, т.е. почти в 1000 раз превышать длину бактериальной клетки. Длительное время считали, что в распределении нитей ДНК бактериальной хромосомы не прослеживается никакой закономерности. Однако если исходить из того, что молекула ДНК образует беспорядочный клубок, трудно объяснить процесс репликации и последующее распределение образовавшихся хромосом по дочерним клеткам. Специальные исследования показали, что хромосомы прокариот представляют собой высокоупорядоченную структуру, имеющую константу седиментации 1300-2000S для свободной и 3200-7000S для связанной с мембраной формы. В том и другом случае часть ДНК в этой структуре представлена системой из 20-100 независимо суперспирализованных петель. В обеспечении суперспирализованной организации хромосом участвуют молекулы РНК .

Хромосомы большинства прокариот имеют молекулярную массу в пределах величины (1-3), умноженной на 10 в степени 9 Да. В группе микоплазм генетический материал представлен молекулами, имеющими наименьшее для клеточных организмов количество ДНК: (0,4-0,8), умноженное на 10 в степени 9, а наибольшее содержание ДНК обнаружено у нитчатых цианобактерий (8,5, умноженное на 10 в степени 9). Хотя каждая прокариотная клетка содержит 1 хромосому, часто в экспоненциально растущей культуре количество ДНК на клетку может достигать массы 3, 4, 8 и более хромосом. Нередко в клетках при действии на них определенных факторов (температуры, рН среды, ионизирующего излучения, солей тяжелых металлов, некоторых антибиотиков и др.) происходит образование множества копий хромосомы. При устранении воздействия этих факторов, а также после перехода в стационарную фазу в клетках, как правило, обнаруживается по одной копии хромосомы. Следовательно, термины "нуклеоид" и "хромосома" не всегда совпадают. В зависимости от условий нуклеоид прокариотной клетки может состоять из одной или некоторого числа копий хромосомы

Ядро (nucleus): содержащая ядерный геном структура, окруженная мембраной в организмах эукариот.

Ядро - самая крупная органелла эукариотической клетки, обычно в диаметре от 3 до 10 мкм. В ядре находятся молекулы ДНК , в которых хранится информация в подавляющем большинстве признаков клетки и организма в целом. ДНК образуют комплексы с гистонами -белками, содержащими большое количество лизина и аргинина. Такие комплексы - хромосомы видны в световой микроскоп в период делений клетки. В неделящейся клетке хромосомы не видны - нити ДНК вытянуты и очень тонки.

Содержимое ядра отделено от цитоплазмы ядерной оболочкой , состоящей из двух близко расположенных друг к другу мембран. Каждая мембрана толщиной 8 нм, расстояние между ними ~30 нм. Через определенные интервалы обе мембраны сливаются друг с другом, образуя отверстия с диаметром 70 нм - ядерные поры ( рис. 24 ). Число пор непостоянно, оно зависит от размеров ядер и их функциональной активности. Например, в крупных ядрах половых клеток может быть до 10#6 пор. Через поры происходит обмен различными веществами между ядром и цитоплазмой. Из ядра выходят молекулы и-РНК и т-РНК , участвующие в синтезе различных белков. В ядро проходят белки, взаимодействующие с молекулами ДНК. В ядре собираются рибосомы из рисобомных РНК , образующихся в ядре, и рибосомных белков , синтезирующихся в цитоплазме. Место сборки рибосом под микроскопом выглядит как округлое тельце диаметром около 1 мкм. Оно называется ядрышком . В ядре может быть одно или несколько ядрышек. Ядерный сок, или кариоплазма (греч. karyon - орех, ядро ореха), в виде бесструктурной массы окружает хромосомы и ядрышки. Вязкость кариоплазмы примерно такая же, как и гиалоплазмы, а кислотность выше. В ядерном соке содержатся белки и различные РНК. Под электронным микроскопом видно большое количество гранул - это транзитные рибосомы, идущие из ядра в цитоплазму.