35. Методы изучения ферментов бактерий. Практическое использование.

Ферментный состав МО определяется его геномом и является стабильным признаком, поэтому определение сахаролитических и протеолитических свойств является дифференциально-диагностическим.

По локализации:

- экзоферменты (во внешнюю среду)

- эндоферменты (в ЦП или ЦПМ)

Функциональное назначение экзоферментов связано с расщеплением макромолекул в окружающей среде.

Конститутивные ферменты — постоянно синтезируются в микробной клетке

Индуцибельные — их концентрация возрастает в зависимости от наличия соответствующего субстрата.

• В микробной клетке ферменты катализируют многочисленные процессы биосинтеза клеточ­ных структур и получения энергии. У бактерий обнаруживаются основные группы ферментов:

• Оксидоредуктазы – катализируют реакции окисления-восстановления.

• Трансферазы – катализируют реакции переноса различных групп от донора к акцептору.

• Гидролазы – катализируют разрыв связей в субстратах с присоединением воды.

• Лиазы – катализируют реакции разрыва связей в субстрате без присоединения воды или окисления.

• Изомеразы – катализируют превращения в пределах одной молекулы (внутримолекулярные перестройки).

• Лигазы (синтетазы) – катализируют присоединение двух молекул с использованием энергии фосфатных связей:

Часть из них (экзоферменты) выделяется наружу, осуществляя внеклеточные реакции: расщепление макромолекул пита­тельных веществ до простых соединений, разрушение антибиотиков (например, бета- лактамаза инактивирует пенициллин) и др. Эндоферменты катализируют реакции внутри клетки: располо¬женные в цитоплазматической мембране пермеазы переносят питательные вещества в клетку, оксидоредуктазы обеспечивают получение энергии и т.д. Кроме того, болезнетворные бактерии мо¬гут обладать ферментами, выполняющими функцию факторов патогенности. Например, гиалуронидаза расщепляет основное вещество соединительной ткани, фибринолизин участвует в растворении кровяных сгустков, что способствует распространению возбудителя в организме.

Ферменты обладают высокой специфичностью и многообразием у микробов. По индивидуальному набору ферментов (биохимическим свойствам) часто определяют вид микроба. Наибольшее значение при идентификации бактерий имеет определение сахаролитических и потеолитических свойств. При этом изучаемый микроорганизм помещают в питательную среду, содержащую субстрат (углевод или белок) и индикатор. О наличии фермента судят по изменению цвета индикатора, который реагирует на продукты разложения субстрата.

+

Микробные ферменты широко используют в биотехнологии и медицине. С их помощью осу¬ществляют генноинженерные исследования, получают биологически активные вещества, вакцины, сыворотки. В медицине, например, для улучшения пищеварения применяют амилазу и диастазу из аспергиллов, для заживления ран (ожогов) - коллагеназу из клостридий.

Методы определения ферментативной активности микробов

Обязательным условием идентификации выделенной чистой культуры бактерий является определение ферментативной активности в отношении углеводов и белков (биохимический «паспорт» вида).

Для выявления ферментов, расщепляющих углеводы (сахаролитические ферменты) используют дифференциально-диагностические среды Гисса.

В состав сред Гисса входит пептонная вода, индикатор рН, поплавок для улавливания газа и один из углеводов (глюкоза, лактоза, мальтоза, маннит, сахароза, крахмал и т.д.). Если бактерии расщепляют углевод, то образуется кислота и при этом меняется цвет среды за счет находящегося в ней индикатора рН. Большинство патогенных бактерий расщепляют углеводы с образованием только кислоты; некоторые виды ферментируют углеводы с образование кислоты и газа (СО2).

При этом меняется цвет среды и в поплавке появляется пузырек газа.

Протеолитическая активность бактерий. Показателями глубокого расщепления белка является образование индола, аммиака, сероводорода. Для выявления этих газообразных веществ делают посевы чистой культуры бактерий на мясо-пептонный бульон или пептонную воду в пробирки со специальными бумажными индикаторами.

При наличии продуктов расщепления меняется цвет соответствующего индикатора.

Протеолитическую активность бактерий определяют также путем посева чистой культуры уколом в столбик желатина по наличию и характеру разжижения среды, например, в виде перевернутой елочки, гвоздя, воронки и т.д.