12. Световой микроскоп, микроскопия с иммерсией. Разрешающая способность. Ультрамикроскоп (темнопольный). Применение. Способы приготовления микропрепаратов.
Устройство и работа светового микроскопа
Микроскоп - сложный оптический прибор, используемый для изучения морфологии и тинкториальных свойств микроорганизмов.
Принципиально все микроскопы устроены одинаково и состоят из механической части и оптической системы.
Механическую часть составляют: основание микроскопа, тубусодержатель, тубус, система винтов для передвижения поля зрения, предметный столик и револьвер с объективами.
Оптическую часть составляют - окуляр, объективы и осветительный аппарат.
Объектив малого увеличения (х8) применяют главным образом для предварительного осмотра препарата,
объективы среднего увеличения (х20, х40) - для изучения крупных клеток микроорганизмов (например, грибов); эти объективы называются сухими, поскольку при микроскопии между фронтальной линзой и препаратом находиться воздух.
При этом благодаря различию показателей преломления воздуха (n=1) и стекла (n=1,52) часть лучей, освещающих препарат, рассеивается и не попадает в объектив.
Объектив больших увеличений (х90) носит название иммерсионного. При работе с ними необходима максимальная освещенность препарата; устранение рассеивания, неизбежного при работе с сухими объективами, в данном случае достигается путем использования иммерсионных жидкостей, у которых показатель преломления близок к показателю преломления стекла.
Для изучения микробов в микроскопе требуется увеличение примерно в 1000 раз. Поэтому используется микроскопы с иммерсионной системой ("иммерсио" - погружение).
В состав иммерсионной системы входит: иммерсионный объектив (х90) и иммерсионное масло, которым заполняют разрыв между изучаемый предметом и передней линзой иммерсионного объектива.
Поскольку показатели преломления стекла и масла близки, это позволяет избежать потери световых лучей вследствие их отклонения, и, тем самым, создать оптимальную освещённость поля зрения. Необходимость в концентрации светового пучка обусловлена также и чрезвычайно малым диаметром передней линзы иммерсионного объектива.
При микроскопировании необходимо помнить, что объективы "сухой системы" не предназначены для погружения в масло, которое может привести их в негодность.
Микроскопия с иммерсионной системой позволяет изучать убитые микробы в окрашенном состоянии (их форму, размеры, взаимное расположение, строение бактериальной клетки) и дифференцировать одни микробы от других. Способность микробов окрашиваться различными методами называют тинкториальными свойствами. В некоторых случаях (изучение морфологии грибов, простейших, других относительно крупных объектов в живом неокрашенном состоянии) используется световой микроскоп с затемнённым полем зрения (объективы х40 или х8)
Для микроскопии готовят препараты "раздавленная капля" или "висячая капля". Разрешающая способность световых микроскопов ограничена волновой природой света и явлениями дифракции видимого света на частицах, размеры которых соизмеримы с длиной волны.
Следовательно, для наблюдения мелких частиц длина волны X должна быть значительно уменьшена. Небольшой длиной обладают электронные волны, величину которых можно изменять в широких пределах, направляя электронный пучок через поля разного напряжения. Максимальная разрешающая способность светового микроскопа 0 2 мкм. Пределом разрешающей способности обычного светового микроскопа является диаметр частиц около 0 2 мк, но при этом размере уже нельзя разобрать деталей формы. В ультрафиолетовом микроскопе Брумберга нижний наблюдаемый размер, который, как известно, тем ниже, чем короче длина применяемых волн, может быть доведен до 0 1 мк. Однако для коллоидных частиц эти пределы слишком грубы.
Иммерсионная система включает:
- иммерсионный объектив
- иммерсионное масло
Масло заполняет прорыв между изучаемым предметом и передней линзой (защита от преломления лучей)
Правила работы с иммерсионным объективом.
1. Поставить микроскоп перед собой.
2. Поднять конденсор до уровня предметного столика.
3. Открыть ирис-диафрагму.
4. Глядя сбоку в верхнюю линзу конденсора и вращая зеркало, найти изображение источника света.
5. Установить иммерсионный объектив.
6. На предметный столик поместить препарат с каплей иммерсионного масла.
7. Закрепить препарат клеммами.
8. Макровинтом опустить тубус до соприкосновения линзы иммерсионного объектива (х90) с маслом. Осторожно погрузить линзу в масло (под контролем глаз с боку).
9. Глядя в окуляр, макровинтом медленно поднимать тубус до появления изображения в поле зрения. Иммерсионные объективы имеют короткое фокусное расстояние (до 2,3 мм) поэтому наводить на резкость следует путем поднимания объектива, а не опускания его, так как при небольшом рабочем расстоянии можно раздавить препарат и повредить фронтальную линзу.
10. Вращая микровинт, не более чем на пол-оборота, добиться четкого изображения.
11. После просмотра препарата привести микроскоп в исходное состояние: макровинтом поднять тубус, снять препарат, закрыть ирис диафрагму, опустить конденсор, установить малое увеличение и снять масло с объектива кусочком салфетки.+
Темнопольная микроскопия.
Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля). Эффект достигается с помощью параболоид- или кардиоидконденсора, которые заменяют обычный конденсор в биологическом микроскопе .
