109. Возбудители холеры. Биологические свойства, факторы вирулентности. Правила забора и транспортировки материала в лабораторию. Особенности патогенеза.

Семейство: Vibrionaceae

Род: Vibrio

Вид: V. cholerae

Биовары: V. cholerae cholerae (asiaticae, classicae)

V. cholerae eltor

V. cholerae bengalii (О139)

Всего род Vibrio включает 36 видов (V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. metschnigovii, V. proteus, V. albensis, V. al-ginoluticus, V. mimicus, V. damsela… – возбудители холероподобных заболеваний)

Возбудители холеры относятся к роду Vibrio, семейства Vibrionaceae. Внутри вида Vibrio cholerae различают два ос-новных биовара: биовар cholerae classic, открытый Р. Кохом в 1883 г., и биовар El- 7or, выделенный в 1906 г. в Египте Ф. и Е. Готшлихами на карантинной станции Эль-Тор.

Морфология и тинкториальные свойства.

Холерный вибрион - грамотрицательная палочка в форме запятой, длиной 2-4 мкм, толщиной 0,5 мкм. Не образует спор и капсулы, монотрих, чрезвычайно подвижен.

Слегка изогнутые грамотрицательные палочки (хорошо окрашиваются анилиновыми красителями) средних размеров (0,2-0,4

кой, образованной выростом наружного слоя клеточной стенки и напоминающей ундулирующую мембрану), спор и капсул не образует. В старых культурах – полиморфны (кокковидные и нитевидные формы). В мазках из нативного материала располагаются в виде «стайки рыб». При лечении антибиотиками подвижность уменьшается и может пре-вращаться в L-формы.

Культуральные свойства.

Является факультативным анаэробом, но предпочитает аэробные условия роста, поэтому на поверхности жидкой питательной среды образует пленку. Холерный вибрион неприхотлив в росте и может расти на простых средах. Оп-тимальная температура роста 37 °С и рН 8,5-9,0. Для оптимального роста требует присутствия в среде 0,5% натрия хлорида. Средой накопления является 1% щелочная пептонная вода, на которой он образует пленку в течение 6-8 ч. Элективной средой является TCBS-среда (тиосульфат-цитратный сахарозо-желчесодержащий агар), на котором обра-зует колонии желтого цвета. Щелочной агар и триптонсоевый агар (ТСА) используют для субкультивирования.

Строгий аэроб (факультативный анаэроб, но лучше растет в аэробных условиях), хемоорганогетеротрофы, оптималь-ная температура роста 370С, время культивирования – 6-24 часа, хорошо растет на обычных питательных средах, но требователен к pH (галофил), оптимальная pH 8,0-9,0. В 1% щелочной пептонной воде через 6-8 часов отмечается рост в виде нежной, тонкой, голубоватой пленки (при встряхивании разрушается).

На плотной среде (щелочной агар) через 10-12 часов вырастают мелкие (1,5-2 мм), маслянистые, гладкие, прозрачные, голубоватые колонии с ровным краем (S-формы).

При длительном культивировании колонии увеличиваются в размерах, становятся мутными, с плотным центром, пигментированные (коричневого или желтого цвета), шероховатые (R-формы), бактерии из них не чувствительны к бактериофагам, антибиотикам и не агглютинируются О-сывороткой. На щелочно-кровяном агаре V. eltor дает зону гемолиза. На ТСBS-агаре (с тиосульфатом, цитратом, солями желчных кислот и сахарозой) образуют желтые колонии.

Биохимические свойства.

Биохимически активен. Оксидазоположителен. Обладает протеолитическими и сахаролитическими свойствами: про-дуцирует индол, лизиндекарбоксилазу, разжижает в воронковидной форме желатин, сероводород не продуцирует. Ферментирует глюкозу, сахарозу, маннозу, крахмал, лактозу (медленно). Не сбраживает рамнозу, арабинозу, дуль-цит, инозит, инулин. Обладает нитратредуктазной активностью.

Активны, оксидазоположительны, V. cholerae eltor и V. cholerae bengalii могут давать положительную реакцию Фоге-са-Проскауэра, расщепляют многие сахара (глюкозу, лактозу, мальтозу, маннит, гликоген, крахмал…) с образованием кислоты без газа. По способности ферментировать сахарозу, арабинозу и маннозу все вибрионы по классификации Хейберга разделены на 6 групп. Холерные вибрионы принадлежат к 1 группе – расщепляют сахарозу, маннозу и не расщепляют арабинозу. Также не сбраживают рамнозу, дульцит, инулин, инозит. Разжижают желатин в виде ворон-ки, образуют индол, разлагают мочевину до аммиака, восстанавливают нитраты в нитриты, свертывают кроличью плазму, разжижают свернутую сыворотку, молоко. Н2S не образуют.

Холерные вибрионы различаются по чувствительности к бактериофагам. Классический холерный вибрион лизируется бактериофагами IV группы по Mukerjee, вибрион биовара Эль-Тор - бактериофагами V группы. Дифференциация сре-ди биоваров возбудителей холеры проводится по биохимическим свойствам, а также по способности гемолизиро-вать эритроциты барана, агглютинировать куриные эритроциты; чувствительности к полимиксину и чувствительности к бактериофагам. Биовар El-Tor резистентен к полимиксину, агглютинирует куриные эритроциты и гемолизирует эритроциты барана, дает положительный результат в реакции Фогеса-Проскауэра и гексаминовом тесте. V. diolerae О139 по фенотипическим признакам относится к биовару El-Tor.

Антигенная структура.

Холерный вибрион обладает О- и Н-антигенами. В зависимости от строения О-антигена различают более 200 серо-групп, среди которых возбудителями холеры являются серогруппы О1 и О139. Внутри серогруппы О1 в зависимости от

сочетания А-, В- и С-субъединиц происходит подразделение на серовары: Огава (АВ), Инаба (АС) и Гикошима (АВС). Вибрионы серогруппы О139 агглютинируются только сывороткой О139. Н-антиген является общеродовым антигеном.

v О-антиген – группо- и типоспецифический, термостабильный ЛПС КС. В роду Vibrio по О-антигену выделяют более 200 серогрупп. Холерный вибрион относится к О1 и О139 группам. Внутри О1 группы О-антиген неоднороден и вклю-чает три компонента – А, В и С, по сочетанию которых выделяют три серотипа: АВ – Огава (Ogava), АС – Инаба (Inaba), АВС – Гикошима (Hicoshima). Вибрионы, не агглютинирующиеся сыворотками групп О1 и О139, называются неагглю-тинируемыми – НАГ вибрионами, вызывают холероподобные заболевания.

v Н-антиген – термолабильный, общий, белковой природы.

v Эндотоксин – стимулирует выработку вибриоцидных антител.

v Холероген – запускает синтез антитоксических антител.

Факторы патогенности.

Факторы патогенности. Главными факторами патогенности являются холерный энтеротоксин (СТ), токсинкорегулиру-емые пили (Тср), нейраминидаза и растворимая гемагглютининпротеаза.

Токсинкорегулируемые пили являются пилями IV типа, которые обеспечивают колонизацию микроворсинок тонкой кишки, участвуют в образовании биопленок на поверхности панциря гидробионтов, а также являются рецепторами для конвертирующего бактериофага СТХ.

Холерный энтеротоксин - белок с молекулярной массой 84 000 Д, синтез которого осуществляется геном, локализо-ванном на бактериофаге СТХ. Только серогруппы О1 и О139 лизогенизированы этим бактериофагом. Токсин состоит из 1 субъединицы А и 5 субъединиц В. Субъединица А состоит из 2 полипептидных цепочек А1 и связанных между собой дисульфидными мостиками. В субъединичном комплексе В 5 одинаковых полипептидов соединены друг с другом нековалентной связью в виде кольца.

В-субъединицы ответственны за связывание всей молекулы токсина с клеточ-ным рецептором, которым является моносиаловый ганглиозид GM1, им очень богаты эпителиальные клетки слизи-стой оболочки тонкой кишки. Для того чтобы В-субъединицы могли взаимодействовать с рецептором GM1, от него должна быть отщеплена сиаловая кислота, что осуществляется ферментом нейраминидазой, которая способствует реализации действия токсина.

Прикрепление В-субъединичного комплекса к мембране кишечного эпителия позво-ляет субъединице А1 проникнуть в клетку, где она активирует аденилатциклазу, переводя ее в постоянное активное состояние, следствием чего является усиление синтеза цАМФ. Под влиянием цАМФ в кишечнике изменяется актив-ный транспорт ионов. В области крипт эпителиоцитами усиленно выделяются ионы Cl-, а в области ворсинок затруд-няется всасывание Na и Cl, что составляет осмотическую основу для выделения в просвет кишечника воды.

Растворимая гемагглютининпротеаза играет важную роль в откреплении возбудителя от поверхности кишечника в результате ее деструктивного действия на рецепторы кишечного эпителия, ассоциированные с вибрионами, давая возможность возбудителю инфицировать новые участки тонкой кишки. Кроме того, у холерного вибриона имеется эндотоксин, который, активируя каскад арахидоновой кислоты, запускает синтез простагландинов, результатом дей-ствия которых являются сокращение гладкой мускулатуры кишечника и развитие тенезм, а также добавочные белко-вые токсины (zonulo и энтеротоксины), которые участвуют в увеличении проницаемости стенки кишечника.

Токсины:

v Эндотоксин – ЛПС клеточной стенки, термостабильный, вызывает местное воспаление в тонком кишечнике, его сокращение (запускает каскад арахидоновой кислоты, что приводит к синтезу простагландинов E, F) и индуцирует синтез антител.

v Экзотоксин=энтеротоксин=холероген (основная роль в патогенезе) – термолабильный белок, состоит из двух ком-понентов: А и В. Компонент В – нетоксичный, обладает способностью соединяться с рецепторами эпителиальных клеток тонкого кишечника, облегчая проникновение в клетку компонента А. Компонент А составляют субъединица А1 (активный центр) и субъединица А2, связывающая А и В. Субъединица А1 активирует внутриклеточную аденилатцик-лазу, приводя к увеличению внутриклеточного содержания цАМФ и выходу жидкости и электролитов из клеток либеркюновых желез в просвет кишечника.

Ферменты патогенности:

v Нейраминидаза;

v Гиалуронидаза;

v Муциназа;

v Протеазы;

v Лецитиназа;

v Гемолизин V. eltor.

Структурные и химические компоненты клетки:

v Пили I типа;

v Жгутик, обусловливающий движение, а также преодоление слизистого слоя и взаимодействие с эпителиальными клетками;

v Фактор G – фактор проницаемости.

Резистентность.

Отношение к факторам окружающей среды. Возбудители холеры чувствительны к УФ-лучам, высушиванию, дезин-фектантам (за исключением четвертичных аминов), кислым значениям рН, нагреванию. Источниками инфекции яв-ляются больной человек, бактерионосители, а также водная среда и гидробионты. Носительство вибриона Эль-Тор встречается чаще, чем классического вибриона (на 1 больного холерой приходится 10-1000 носителей). Возбудитель холеры, особенно биовар Эль-Тор, способен к существованию в воде в симбиозе с гидробионтами, водорослями, в неблагоприятных условиях может переходить в некультивируемую форму. Эти свойства позволяют отнести холеру к антропонозно- сапронозным инфекциям.

Выживаемость во внешней среде зависит от pH среды, вибрионы чувствительны к действию прямых солнечных лу-чей, высокой температуре (при 500С погибают за 30 минут, 1000С – через несколько секунд), высушиванию. В откры-тых водоемах сохраняются от нескольких дней до 3 месяцев, в почве от 8 дней до 3 месяцев, в выгребных ямах – до 3-4 месяцев, в морской воде до 47 суток, в сточных водах – 1-2 суток. Сохраняются в молоке и молочных продуктах от 5 дней до 4 недель, на фруктах 1-2 дня, на сырых овощах – 2-4 дня. Устойчивы к действию низких температур (во льду могут сохраняться до 1-4 месяцев).

Высокочувствительны к кислотам (KMnO4 – 15 минут), хлорсодержащим дезсред-ствам (10 минут), антибиотикам тетрациклинового ряда, V. eltor устойчив к полимиксину в отличие от V. cholerae asiatica

Патогенез и клинические особенности.

Инкубационный период от 2 ч до 6 дней. Болезнь развивается остро с повышения температуры тела до 38-39 °С, рво-ты, поноса, болей в животе, тенезм. Стул имеет вид рисового отвара. Резкое обезвоживание приводит к нарушениям деятельности сердечно-сосудистой и дыхательной систем, развитию почечной недостаточности. При отсутствии ле-чения болезнь может перейти в стадию холерного алгида (от лат. algidus - холодный), характерным признаком кото-рого является снижение температуры тела до 34 °С. При отсутствии лечения холерный алгид заканчивается летально.

Входные ворота – тонкий кишечник, основная роль принадлежит холерогену, вызывающему дегидратацию и обессо-ливание организма. Вибрион находится только в тонком кишечнике, размножается, не распространяясь по организ-му, вибрионемия отсутствует.

Инкубационный период – от нескольких часов до 2-3 дней.

Клинические периоды холеры:

1. Холерный энтерит: на фоне нормальной температуры редкий жидкий стул, боли в животе, тенезмы, через 1-2 дня присоединяется рвота.

2. Острый гастроэнтерит: частая рвота, урчание в животе, испражнения приобретают вид «рисового отвара» (мутная жидкость с плавающими остатками слизи и клетками эпителия), акты дефекации учащаются (выделяют до 30 литров в сутки), язык покрывается налетом, количество мочи уменьшается, выраженная жажда, обезвоживание.

3. Холерный алгид – t 35°C, кожные покровы серые, синюшные, морщинистые, лицо Гиппократа (facies hippocratica): нос заострен, глаза запавшие, выступающие скулы, афония, гипотония. Смерть наступает от сердечно-сосудистой и почечной недостаточности в результате обезвоживания и интоксикации

2.Принципы лабораторной диагностики холеры.

Микробиологическая диагностика.

Основу микробиологической диагностики составляют выделение и идентификация возбудителя.

Материалом для исследования служат испражнения, рвотные массы, пищевые продукты, вода, гидробионты, смывы с объектов окру-жающей среды. Материал засевается на элективную питательную среду, TCBS-агар с последующим субкультивиро-ванием на неселективных средах и идентификацией по антигенной структуре и биохимическим свойствам. Дополни-тельно факультативно можно сделать посев и на щелочную пептонную воду с последующим субкультивированием на TCBS-агаре. Для экспресс-диагностики используют РИФ и ПЦР.

Исследуемый материал – фекалии, рвотные массы, желчь, секционный материал, мухи, пищевые продукты, вода, ил, гидробионты, сточные воды.

1. Бактериоскопический метод.

2. Бактериологичекий метод (основной).

3. Экспресс-методы – РИФ, реакция иммобилизации вибрионов О1-сывороткой и бактериофагом, ПЦР.

4. Серологический метод – РА, РПГА, РИФ, ИФА.

Предварительный положительный ответ при диагностике холеры выдается через 5-6 часов на основании обнаруже-ния в посевах культур, агглютинирующихся на стекле холерной О1-сывороткой (в разведении не менее 1:100) и по-ложительном результате ускоренных методов исследования.

Окончательный положительный ответ выдается через 18-48 часов на основании выделенных культур, имеющих ти-пичные морфологические признаки с учетом данных развернутой реакции агглютинации с холерными сыворотками О1, Огава, Инаба, пробы с холерными диагностическими фагами, принадлежности к 1 группе Хейберга.