мулой

где <7inc и crCOh — сечения некогерентного и когерентного рассеяния соот­ ветственно; a Scoh (ж, г*/), Sme (*,**/) — динамические факторы когерент­ ного и некогерентного рассеяния. В главах 4 и 7 мы продемонстрируем несколько примеров рассчета динамических факторов для различных моделей ДНК.

Вэкспериментах по рассеянию тепловых нейтронов обычно исполь­ зуют ориентированные волокна ДНК [181]. Методически это дает пре­ имущество для доминирования некогерентного сечения рассеяния водо­ родными атомами и для одновременного исследования широкой области пространства частоты (г*/) и импульса (fc) [182].

Втаком подходе основной проблемой является возможность полу­ чения достаточно больших ориентированных образцов ДНК для того, чтобы добиться выделения атомных смещений посредством проекции на х. Существующие источники тепловых нейтронов требуют, чтобы

размер образца (ДНК) был около 1 см3 Тогда в рамках применяемых на практике временных пределов, равных нескольким дням измерений, уда­ ется достичь определенного уровня статистического значения сигналов от коллективных возбуждений. Частично эта проблема была преодолена благодаря развитию и совершенствованию метода влажного центрифу­ гирования [183]. Этот метод позволяет контролировать производство вы­ сокоориентированных (в пределах нескольких градусов) тонких пленок (от 1 до 100 11м) при помощи наматывания волокон ДНК, которые посто­ янно натягиваются при погружении в водно-спиртовой раствор. Таким способом уже получают пленки вплоть до 45x275 мм2

2.8.3. Инфракрасная спектроскопия

Для изучения структуры различных молекул очень важно знать длину химических связей и углы между ними. Эти данные обычно по­ лучают рентгеновским методом, а также при помощи анализа спектров микроволнового поглощения. Для изучения же внутренней подвижности ДНК необходимо знать изменения этих длин и углов. При физиологи­ ческих условиях колебания атомов и атомных групп сопровождаются изменениями длин связей порядка ±0.05 А и изменениями углов по­ рядка ±5° Изменение энергии этих колебаний соответствует энергиям электромагнитного излучения в инфракрасной области спектра.

Низкочастотные моды инфракрасного спектра, расположенные меж­ ду 40 и 240 см-1 , представляют наибольший интерес. Например, в ра­ боте Битца и Аскарелли [184], а также в работе Уитлинна с соавтора­ ми [185] наблюдалась зависящая от гидратации мода 45 см-1 Ее припи­ сали к сложному внутреннему колебательному движению, причем пары оснований колебались в фазе и в противофазе по отношению к двум сахарофосфатным остовам вдоль оси спирали.

2.8.4. Водородно-дейтериевый (-тритиевый) обмен

Водородно-дейтериевый обмен является довольно мощным инстру­ ментом изучения внутренней динамики ДНК и особенно динамики рас­ крытия пар оснований [10-12]. В его основе лежит тот факт, что поляр­ ные водороды оснований ДНК могут обмениваться с водородами раство­ ра в условиях, когда ДНК находится далеко от какого-либо денатурационного перехода. Из данных экспериментальных наблюдений известно, что молекулы ДНК с высоким молекулярным весом обменивают свои водороды при 0° С с периодом полуобмена 5 мин. в растворе и в солевых условиях таких, при которых температура ее тепловой денатурации вы­ ше 80° С. В то же время известно, что свободные основания способны обменивать свои N-H с раствором значительно более быстро. Эти фак­ ты заставили исследователей предположить, что упорядоченные спирали содержат небольшое количество открытых состояний, в которых осно­ вания не спарены, и что эти открытые состояния являются связующим звеном в обмене иначе недоступных водородно-связанных протонов.

Схему, описывающую такой конформационно-ограниченный обмен, можно записать в следующем виде:

где fc0p — константа скорости раскрытия, кс\ — константа скорости для обратной реакции (закрытия) и ксьет характеризует стадию, связанную с химическим преобразованием. Схема (2.14) записана здесь для случая, когда дейтерий обменивается на протон. Поскольку обмен нуклеотид­ ного протона на дейтерий генерирует специальный сдвиг в ультрафио­ летовой области, можно проследить водородно-дейтериевый обмен при помощи спектрального разностного метода, используя ультрофиолетовую спектрофотометрию. В результате оказалось возможным проводить измерения скорости обмена протонов в широком диапазоне температур.

2.8.5. Микроволновое поглощение

Метод микроволнового поглощения — еще один путь изучения ди­ намики биополимеров. Он был применен к ДНК в работах Вэбба и Бу­ та [43] и позднее в работах Свикорда и Дэвиса [44,45] и Эдвадса с соавторами [46]. Существование продольных акустических резонансов в низкой гигагерцовой области было продемонстрировано в растворах монодисперсной ДНК конечной длины. Однако интерпретация этих на­ блюдений представляет собой довольно сложную проблему. Многие ав­ торы делали попытки решить ее, используя различные динамические модели ДНК, включая и нелинейные модели [30,47,160,186,187]. Их выводы и результаты сейчас активно обсуждаются.

2.8.6. ЯМР

Ядерно-магнитный резонанс (ЯМР) является очень эффективным методом изучения динамических свойств ДНК. Так, чтобы понять ме­ ханизм раскрытия ДНК, необходимо знать обменное поведение нуклеотидов/нуклеозидов. А обменные процессы как раз и находятся в рам­ ках временной шкалы ЯМР. Чтобы исследовать их, проводят измерения ширины линии иминопротонов [143,144,147,188] и таким способом по­ лучают скорости обмена. Изучение коротких фрагментов, содержащих 12, 43 и 69 пар оснований, продемонстрировало обмен иминопротонами в АТ-парах путем раскрытия только одной пары со скоростью раскры­ тия 15 4-20 сек-1 при 38° С и энергии активации 15 4-17 ккал/моль. Эти данные хорошо коррелируют с результатами, полученными для poly(7\A)-poly(r£/), с энергией активации, равной 15 ккал/моль, и ско­ ростью раскрытия, равной 1 сек-1

Еще одной экспериментально измеряемой характеристикой являет­ ся химический сдвиг (положение резонансного сигнала на частотной шкале относительно контрольного сигнала) водородно-связанных имино­ протонов нуклеиновых кислот. Обычно ее используют для определения вторичной и третичной структуры нуклеиновых кислот. Уширение или исчезновение резонансов указывает на «растрепывание» концов и/или на плавление двойной спирали. Растрепывание концов определяется как быстрое раскрытие и закрытие пар оснований на конце спирали, которые приводят к протонному обмену с водой, а плавление — как равновес­ ный процесс, описывающий долю открытых и закрытых пар оснований. Последовательность плавления различных частей нуклеиновых кислот также может быть отслежена при помощи метода ЯМР

В параметрах химического сдвига и константах взаимодействия между ЯМР активными ядрами отражается в основном статическая структура ДНК. В специальных случаях ядерный эффект Оверхаузера (ЯЭО) дает дополнительную информацию о пространственных взаимо­ действиях соседних ядер. Что касается динамических процессов, то они отражаются в основном в скоростях релаксации ЯМР-экспериментов (или релаксационных временах, которые являются величинами, обрат­ ными скоростям) и в ЯЭО. Косвенно релаксационная скорость R2 = = I/T 2, описывающая спин-спиновую релаксацию, отражена в ширине линии обычного спектра ЯМР. Обычно суммарные скорости релакса­ ции Ri = 1/Ti (спин-решеточная релаксация) и Д2 = I/T 2 (спинспиновая релаксация) представляют собой сумму нескольких релакса­ ционных процессов. Трудность проведения исследований в этом направ­ лении заключается в отборе модели для интерпретации релаксационного эксперимента.

2.8.7. Эксперименты по переносу заряда

Хорошо известно, что электронные возбуждения и движение элек­ тронных зарядов играют важную роль в функционировании широко­ го круга макромолекул, представляющих интерес для биологии [189]. Двойная спираль ДНК имеет в своем ядре выстроенную стопку из пар оснований. Основания обладают ароматической 7г-системой, находящей­ ся в контакте с аналогичными системами соседних остатков. А эти свя­ занные 7г-системы представляют собой структуру, которая служит про­ водником для транспорта электронов вдоль ДНК. Несмотря на этот, казалось бы, очевидный факт, долгое время многие исследователи ве­ рили, что молекулы ДНК, как и белки, являются изоляторами и не могут способствовать передаче заряда на большие расстояния. Другие исследователи придерживались мнения, представляющего нечто сред­ нее, и считали, что ДНК может вести себя как полупроводник, переда­ вая заряд только при определенных ситуациях. И только в конце 80-х и в 90-х годах группа Бартона из Калифорнийского института опублико­ вала в журнале Science серию статей [166-168], сообщавших о том, что в построенных ими ансамблях ДНК повреждение может быть стимули­ ровано в некотором сайте, отстоящем на расстоянии от другого сайта, в котором в стопку из пар оснований ДНК был введен радикал. Бар­ тон предположил, что это повреждение было стимулировано переносом электрона вдоль двойной спирали ДНК. С того времени было опублико­ вано много других экспериментальных работ по транспорту заряда вдоль