Алгоритм лабораторной работы.

Определение активности цитохромоксидазы – компонента дыхательной цепи

митохондрий.

Принцип метода. Цитохромы – сложные белки гемпротеины, относятся к классу

ферментов – оксидо-редуктаз, собравшиеся во всех животных и растительных клетках. Благодаря тому, что атомы железа в цитохромах легко изменяют свою валентность, цитохромы является компонентами дыхательной цепи митохондрий и

переносчиками электронов от восстановленного убихинона на кислород. В цитохромной системе передавать электроны на кислород может лишь цитохром а-а3 –

цитохромоксидазы в состав которой входит медь.

Метод определения активности цитохромоксидазы основан на способности диметилпарафенилендиаминхлорида (ДПФД) быть донором электронов для цитохрома с. ДПФД неферментативно восстанавливает цитохром с, а сам окисляясь,

превращается в красный пигмент, количественное образование которого является пропорциональным активности цитохромоксидазы митохондрий.

Ход работы. Две пробирки: контрольную и опытную заполняют реактивами по

таблице:

Добавление этилового спирта инактивирует цитохромоксидазу и ферментативное превращение цитохрома с. Пробирки помещают в термостат на 5 минут при 37оС и

наблюдают за появлением красной окраски.

По результатам проведенного эксперимента сделать выводы.

Тема 12. Хемиосмотическая теория окислительного фосфорилирования. Ингибиторы и разобщители окислительного фосфорилирования.

Актуальность темы.

Митохондриальную систему сопряжения окислительных процессов с генерацией

высокоэнергетического интермедиата АТФ, называют окислительным фосфорилированием.

Окислительное фосфорилирование позволяет организму поглощать значительную долю потенциально свободной энергии окисления субстратов. Обоснование

24

механизма окислительного фосфорилирования позволяет сделать хемиосмотическая теория. Окислительное фосфорилирование является очень важным процессом, нарушение его протекания несовместимо с жизнью.

Цель и исходный уровень знаний.

Общая цель.

Изучить хемиосмотическую теорию окислительного фосфорилирования и условия его эффективного протекания.

Конкретные цели:

1.Трактовать роль биохимического окисления, тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования в генерации АТФ при аэробных условиях.

2.Анализировать нарушение синтеза АТФ при условиях действия на организм

человека патогенных факторов химического, физического и биологического происхождения.

Исходный уровень знаний-умений: знать особенности гистологического строения митохондрий и основы биоэнергетики тканей.

Ориентировочная карта для самостоятельного изучения студентами учебной литературы при подготовке к занятию.

25

Индивидуальная самостоятельная работа студентов.

Обзор научной литературы и подготовка реферативных сообщений по темам:

1.Разобщители окислительного фосфорилирования и регуляция термогенеза.

2.Универсальность хемиосмотической теории для живых систем.

Алгоритм лабораторной работы.

Изучение окислительного фосфорилирования в митохондриях и действие разобщителя– 2,4-динитрофенола на этот процесс.

Принцип метода. В процессе окисления разных субстратов и передачи электронов в дыхательной цепи митохондрий освобождается энергия. Часть этой энергии используется для синтеза АТФ в процессе окислительного

фосфорилирования: АДФ + Фн АТФ

В эксперименте, чтобы предотвратить нагромождение АТФ (высокое содержание АТФ ингибирует ферменты дыхательной цепи) в качестве конечного акцептора неорганического фосфата используют глюкозу. Фосфорилирование глюкозы при

участии АТФ катализирует фермент – гексокиназа:

Глюкоза + АТФ АДФ + глюкозо-6-фосфат

Определение неорганического фосфата основано на способности молибдата аммония в кислой среде присоединять остаток фосфорной кислоты с образованием фосфата аммония. Фосфат аммония под действием восстановителя – аскорбиновой кислоты образует продукты окрашенные в синий цвет. В процессе окислительного

фосфорилирования Фн изымается из инкубационной среды, и поэтому интенсивность

синей расцветки раствора уменьшается.

Разобщители – это соединения которые нарушают сопряженность окисления и фосфорилирования в митохондриях. В присутствии разобщителей наблюдается активное поглощение кислорода митохондриями, однако скорость генерации АТФ –

значительно уменьшается (или отсутствует). Согласно хемиосмотической теории,

разобщители вызывают потерю мембраной электрохимического протонного потенциала – движущей силы генерации макроэргических связей АТФ.

Материалы и реактивы: свежевыделенные митохондрии из мышц кроля; смесь № 1 – 0,08 моль КН2РО4, 0,255 моль KCl, 0,05 моль MgCl2 растворяют в

дистиллированной воде, добавляют 0,1 М раствор КОН к рН = 7,4 и доводят объем в

мерной колбе до 1 л; смесь № 2 – водный раствор глюкозы с АТФ, что содержит 90 мг глюкозы и 30 мг АТФ в 1 мл; гексокиназа в 1%-м растворе глюкозы (0,8 мг гексокиназы в 1 мл); 5%-й раствор сукцината калия; 5%-й раствор уксусной кислоты; 10%-й раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ); 1 %-й раствор динитрофенола; 2,5%-й раствор молибдата аммония в 10 М растворе H2SO4 (2,5 г молибдата аммония растворяют в 50 мл 20 М раствора H2SO4 и доводят объем водой до 100 мл); 5%-й раствор

аскорбиновой кислоты.

Ход работы. Три пробирки – контрольную, опытную № 1 та опытную № 2

заполняют реактивами по таблице:

26