Алгоритм лабораторной работы.

Провести сравнительный анализ активности холинестеразы в разных образцах сыворотки крови (титрование раствором NaOH).

Принцип метода. Холинестераза катализирует реакцию гидролиза ацетилхолина с

образованием холина и уксусной кислоты. В крови человека содержится два вида холинестеразы. В сыворотке содержится неспецифическая псевдохолинестераза, которая расщепляет не только ацетилхолин, но и другие эфиры холина. В

эритроцитах содержится специфическая, истинная ацетилхолинестераза, которая расщепляет лишь ацетилхолин.

Метод выявления и количественного определения холинестеразы основан на титровании щелочью уксусной кислоты, что высвободилась в процессе гидролиза ацетилхолина. Количество щелочи, что пошла на титрование, является мерой

активности фермента.

Ход работы. Берут две пробирки. В первую отмеряют 0,5 мл сыворотки крови №

1, во вторую – 0,5 мл сыворотки крови № 2. Потом в обе пробирки с исследуемыми сыворотками добавляют по 2 мл 2% -го раствора ацетилхолина и инкубируют при 37оС 10 минут. После этого добавляют по 2 капли фенолфталеина и титруют

содержание пробирок 0,1 М раствором NaOH к слабо розовой расцветке.

Количество щелочи, которое пошло на титрование, является мерой активности фермента.

Заполняют таблицу:

По результатам проведенного эксперимента сделать вывод.

Тема 5. Исследование регуляции ферментативных процессов.

Актуальность темы. Протекание биохимических реакций в организме возможно

каталитической активности фермента, изменение количества фермента. Благодаря

Цель и начальный уровень знаний-умений.

Общая цель: изучить регуляцию ферментативных процессов.

Конкретные цели:

1.Анализировать механизмы регуляции основных метаболических процессов.

2.Анализировать пути и механизмы регуляции ферментативных процессов как

основы обмена веществ в организме в норме и при патологиях.

Исходный уровень знаний-умений: знать свойства ферментов, их строение, активные центры.

11

Реакция Фелинга: к 5 кап. исследуемой смеси прибавить 3 кап. раствора Фелинга (CuSO4 + NaOH), подогреть. В присутствии глюкозы или мальтозы выпадает желтый осадок гидрата закиси меди или красный осадок закиси меди.

2. Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы слюны.

В 3 пробирки налить по 1 мл слюны, разведенной в 10 раз (1 мл слюны + 9 мл

воды). В первую пробирку добавить 1 кап. 1% раствора хлорида натрия, во вторую – 1 кап. 1% раствора сернокислой меди, в третью – 1 кап. воды, потом в каждую пробирку добавить по 5 кап. 1% раствора крахмала, перемешать и оставить при

комнатной температуре на 4-5 минут. Провести реакцию на крахмал с реактивом Люголя (КІ3).

Реакция на крахмал: к 5 кап. исследуемой смеси добавить 1 кап. раствора Люголя. В присутствии крахмала появляется синяя окраска.

3. Исследовать влияние фосфакола и ионов кальция на активность холинестеразы.

Принцип метода. Холинестераза катализирует реакцию гидролиза нейромедиатора – ацетилхолина с образованием холина и уксусной кислоты. В крови человека содержится два вида холинестеразы. В сыворотке содержится

неспецифическая псевдохолинестераза, которая расщепляет не только ацетилхолин, но и другие эфиры холина. В эритроцитах содержится специфическая, истинная ацетилхолинестераза, которая расщепляет лишь ацетилхолин.

Фосфорорганические соединения (ФОС, фосфакол) являются необратимыми

ингибиторами холинестеразы и ацетилхолинестеразы, поскольку ковалентно связываются с активным центром фермента и тормозят его активность. Препараты ФОС являются высокотоксичными ядами для насекомых (пестициды) и теплокровных животных. Механизм тормозного действия заключается в связывании с ОН-группой

серина в активном центре фермента.

Рост концентрации ионов Са2+ в нервном окончание является непосредственным биохимическим сигналом, что активирует выход ацетилхолина через пресинаптическую мембрану, его взаимодействие с холинорецепторами постсинаптической мембраны и расщепления медиатора в синаптической щели

ацетилхолинестеразой. Поэтому ионы кальция являются мощным активатором

холинестеразы.

Метод количественного определения холинестеразы основан на титровании щелочью уксусной кислоты, что высвободилась в процессе гидролиза ацетилхолина.

Количество щелочи, которое израсходовано на титрование является мерой

активности фермента.

Ход работы. Три пробирки заполняют реактивами по таблице.

Количество 0,1 М NaOH,

которое израсходовано на

титрование

По результатам проведенного эксперимента сделать выводы.

13