- •Тема 1. Предмет, задачи, основные этапы и современные направления развития биохимии. Цель и методы проведения биохимических исследований, их клинико-диагностическое значение.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 2. Исследование строения и физико-химических свойств белков-ферментов.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Изучить физико-химические свойства белков-ферментов.
- •Тема 3. Определение активности ферментов. Единицы измерения каталитической активности ферментов. Исследование ферментативных процессов по типу реакций основных классов ферментов.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 4. Исследование механизма действия ферментов и кинетики ферментативного катализа.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 5. Исследование регуляции ферментативных процессов.
- •Алгоритм лабораторной работы.
- •Тема 6. Медицинская энзимология.
- •Изменение активности ферментов в тканях может служить критерием биохимической диагностики, а изучение динамики этих изменений указывает на эффективность лечения.
- •Чистые ферменты и их смеси широко используются как лекарственные препараты в терапии, хирургии, офтальмологии и других областях медицины.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 7. Исследование роли кофакторов и коферментных витаминов в каталитической активности ферментов.
- •Тема 8. Исследование роли кофакторов и коферментных витаминов в каталитической активности ферментов.
- •Актуальность темы.
- •Тема 9. Фундаментальные закономерности обмена веществ. Общие пути превращений белков, углеводов, липидов.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 10. Исследование функционирования цикла трикарбоновых кислот.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 11. Биоэнергетические процессы: биологическое окисление, окислительное фосфорилирование.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 12. Хемиосмотическая теория окислительного фосфорилирования. Ингибиторы и разобщители окислительного фосфорилирования.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 13. Исследование гликолиза – анаэробного окисления глюкозы.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 14. Исследование аеробного окисления глюкозы.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 15. Альтернативные пути обмена моносахаридов. Метаболизм фруктозы и галактозы.
- •Тема 16. Исследование катаболизма и биосинтеза гликогена. Регуляция обмена гликогена.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 17. Глюконеогенез.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 18. Исследование механизмов метаболической и гормональной регуляции обмена углеводов.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 19. Исследование катаболизма и биосинтеза триацилглицеролов. Установление молекулярных механизмов регуляции липолиза.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 20. Транспортные формы липидов.
- •Актуальность темы.
- •Количественное определение β- и пре-β-липопротеидов имеет большое значение для диагностики атеросклероза, ишемической болезни сердца (ИБС), ожирения, хронических заболеваниях печени, так как позволяет выявить повреждение паренхимы печени.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 21. Бэта-окисление жирных кислот. Исследование обмена жирных кислот и кетоновых тел.
- •Тема 22. Биосинтез жирных кислот. Обмен сложных липидов.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 23. Биосинтез и биотрансформация холестерола. Исследование нарушений липидного обмена: стеаторея, атеросклероз, ожирение.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 24. Исследование превращений аминокислот (трансаминирование, дезаминирование, декарбоксилирование).
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 25. Биосинтез глутатиона и креатина.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 26. Исследование процессов детоксикации аммиака и биосинтеза мочевины.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 27. Биосинтез порфиринов. Наследственные нарушения обмена порфиринов.
- •БИОХИМИЯ ТКАНЕЙ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ФУНКЦИЙ
- •Тема 1. Строение и функции нуклеиновых кислот.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 2. Исследование биосинтеза и катаболизма пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов. Определение конечных продуктов их обмена.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Знать биохимическую динамику превращения нуклеотидов, основы их патохимии и биохимической диагностики.
- •Индивидуальная самостоятельная работа студента.
- •Подготовить реферат на тему: «Подагра, возможные причины и клинические проявления».
- •Тема 3. Исследование репликации ДНК и транскрипции РНК.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 4. Биосинтез белка на рибосомах. Исследование процессов инициации, элонгации и терминации в синтезе полипептидной цепи. Ингибиторное действие антибиотиков.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 5. Регуляция экспрессии генов.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 6. Анализ механизмов мутаций, репараций ДНК. Усвоения принципов получения рекомбинантных ДНК, трансгенных белков.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 7. Исследование молекулярно-клеточных механизмов действия гормонов белково-пептидной природы на клетки-мишени. Гормоны гипоталамуса и гипофиза.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 8. Исследование молекулярно-клеточных механизмов действия стероидных гормонов на клетки-мишени. Стероидные гормоны.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 9. Исследование роли тиреоидных гормонов и биогенных аминов в регуляции метаболических процессов.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 10. Гормоны поджелудочной железы. Гормоны пищеварительного тракта.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 11. Гормональная регуляция гомеостаза кальция.
- •Тема 12. Физиологически активные эйкозаноиды.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 13. Исследование процесса переваривания питательных веществ (белков, углеводов) в пищеварительном тракте.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 14. Исследование процесса переваривания питательных веществ (липидов) в пищеварительном тракте.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 15. Исследование функциональной роли жирорастворимых витаминов в метаболизме и реализации клеточных функций.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 16. Исследование белков плазмы крови: белков острой фазы воспаления, собственных и индикаторных белков.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 17. Исследование кислотно-основного состояния крови и дыхательной функции эритроцитов. Патологические формы гемоглобинов.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 18. Исследование азотистого обмена и небелковых азотосодержащих компонентов крови – конечных продуктов катаболизма гема.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 19. Исследование биохимических закономерностей реализации иммунных процессов. Иммунодефицитные состояния.
- •Тема 20. Биохимия печени. Патобиохимия желтух.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •17,1 34,2 51,3 68,4 85,5 102,6 мкмоль/л
- •Тема 22. Исследование нормальных компонентов мочи.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 23. Исследование патологических компонентов мочи.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 24. Биохимия мышц и мышечного сокращения.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 25. Биохимия соединительной ткани.
- •Цель и исходный уровень знаний.
- •Тема 26. Биохимия костной ткани. Факторы риска остеопороза.
- •Тема 27. Биохимия нервной ткани.
- •Цель и начальный уровень знаний.
- •ИТОГОВЫЙ КОНТРОЛЬ УСВОЕНИЯ МОДУЛЯ
- •СОДЕРЖАНИЕ
Алгоритм лабораторной работы.
Количественное определение холестерола в крови по Ильку.
Принцип метода: Холестерол при взаимодействии с уксусным ангидридом в присутствии концентрированных серной и уксусной кислот образует продукты реакции
сине-зеленого цвета. Интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству холестерола.
Ход работы.
Пробирки и микропипетки должны быть сухими. В две центpифужные мерные
пробирки наливают по 2 мл реактива Илька (Осторожно, концентрированные кислоты!!!); потом в одну из них отмеряют 0,1 мл стандартного раствора холестерола, а во вторую - 0,1 мл исследуемой сыворотки. Содержание пробирок осторожно
стряхивают для перемешивания и оставляют на 20 минут. Потом растворы фотометриpуют на ФЭК при красном светофильтре (λ = 630-690 нм). По величинам
оптической плотности (экстинкции) стандарта и сыворотки составляют пропорцию и рассчитывают концентрацию холестерола в исследуемой сыворотке.
В норме концентрация холестерола (общего) в сыворотке взрослого человека
составляет 3,1 – 5,2 ммоль/л (120-250 мг%). Эфиpосвязанный холестерол сыворотки
составляет 2/3 общего холестерола.
Тема 24. Исследование превращений аминокислот (трансаминирование, дезаминирование, декарбоксилирование).
Актуальность темы.
Впроцессе декарбоксилирования аминокислот в тканях образуются активные соединения – биогенные амины (ГАМК, дофамин, гистамин, серотонин, норадреналин,
адреналин), и амины – эндогенные токсины (путресцин, кадаверин) при гниении
белков в кишечнике.
Впроцессе дезаминирования аминокислот образуются кетокислоты, которые
могут использоваться в процессе трансаминирования для синтеза заменимых аминокислот.
Аланинаминотрансфераза (АлАТ) является гепатоспецифическим ферментом,
аспартатаминотрансфераза (АсАТ) является кардиоспецифическим ферментом. Эти ферменты используются для энзимодиагностики заболеваний печени и миокарда.
Цель и исходный уровень знаний.
Общая цель:
1.Усвоить принцип метода и оценку клинического значения определения активности АлАТ и АсАТ.
2.Воспроизвести в эксперименте процесс переаминирования с использованием глутаминовой и пировиноградной кислот.
Конкретные цели:
1.Трактовать биохимические закономерности внутриклеточного метаболизма
аминокислот: процессы тpансаминирования, дезаминирования,
декаpбоксилирования, объяснять биологическое действие образуемых биогенных аминов: серотонина, гистамина, гамма-аминомасляной кислоты.
2.Написать уравнение реакции переаминирования глутаминовой и пировиноградной кислот.
46
Исходный уровень знаний-умений: уметь писать формулы 20 аминокислот. Применять метод хроматографии для выявления аминокислот.
Ориентировочная карта для самостоятельного изучения студентами учебной литературы при подготовке к занятию.
Содержание |
и |
Указания к учебным действиям |
|
|
|||||
последовательность действий |
|
|
|
|
|
|
|
||
1. |
Практическое |
изучение |
1.1. |
Определение |
|
активности |
|||
определения |
активности |
аминотрансфераз в сыворотке крови. |
|
||||||
аминотрансфераз в |
сыворотке |
|
|
|
|
|
|
|
|
крови. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
2. |
Пул |
свободных |
2.1. |
Пути |
поступления |
свободных |
|||
аминокислот в организме. |
аминокислот в ткани. |
|
|
|
|
||||
|
|
|
2.2. |
Пути |
использования |
свободных |
|||
|
|
|
аминокислот в тканях. |
|
|
|
|||
3. |
Общие пути превращения |
3.1. |
Трансаминирования |
аминокислот: |
|||||
аминокислот. |
|
реакции и их биохимическое значение. |
|
||||||
|
|
|
3.2. |
Написать |
уравнение |
реакций |
|||
|
|
|
переаминирования |
глутаминовой |
и |
||||
|
|
|
пировиноградной кислот. |
|
|
|
|||
|
|
|
3.3. |
|
Механизм |
|
действия |
||
|
|
|
аминотрансфераз. |
|
|
|
|
||
|
|
|
3.4. |
Прямое |
и |
|
непрямое |
||
|
|
|
дезаминирование |
свободных |
|
L- |
|||
|
|
|
аминокислот в тканях. |
|
|
|
|||
|
|
|
3.5. |
Декарбоксилирование |
L- |
||||
|
|
|
аминокислот в организме человека. |
||||||
|
|
|
Физиологичное |
значение |
образованных |
||||
|
|
|
продуктов. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
3.6. Окисление биогенных аминов. |
|
|||||
Задание для индивидуальной самостоятельной работы студентов.
1.Строить схемы и писать биохимические реакции превращения аминокислот в
метаболических процессах дезаминирования, трансаминирования и
декарбоксилирования.
2.Анализировать и трактовать молекулярные механизмы регуляции обмена аминокислот и отдельных метаболических путей.
3.Подготовить реферативное сообщение: ”Клиническое значение определения аминотрансфераз”.
Алгоритм лабораторной работы.
1. Воспроизвести в эксперименте процесс трансаминирования, используя глутаминовую и пировиноградную кислоты.
Принцип метода: заключается в том, что в процессе ферментативного переноса
аминогруппы с глутаминовой кислоты на кетокислоту (ПВК) образуется аланин. О том, что проходит переаминирование, заключают по появлению аланина на хромотограме.
Ход работы: в две пробирки отмеряют по 0,5 мл раствора глутаминовой кислоты, 0,5 мл раствора ПВК, 1 мл раствора углекислого калия и 0,25 мл раствора
монобромуксусной кислоты.
В 1 пробирку (опыт) добавляют 0,5 мл свежей мышечной кашки, во вторую пробирку - мышечную кашку, которая предварительно прокипячена на протяжении 1-2 минут. Обе пробирки ставят в термостат при t = 37оС на 15 минут. Потом в каждую
47
добавляют по 0,25 мл уксусной кислоты и кипятят 2-3 минуты до полного осаждения белков. Содержимое пробирок фильтруют.
Фильтраты хроматографируют. С этой целью на линии старта двух полосок
фильтровальной бумаги (опыт и контроль) наносят по капле фильтратов из пробирок, каждый раз подсушивая на воздухе. Полоски бумаги опускают в пробирки, на дне
которых находится фенол, насыщенный водой. Пробирки в штативе помещают в термостат на 1 час при 35-40оС. После этого полоски бумаги вынимают, отмечают линию фронта (финиш) растворителя, подсушивают 10-15 минут при 100оС, а затем
проявляют раствором нингидрина. Снова подсушивают.
Для каждого определенного пятна вычисляют коэффициент Rf по формуле:
Rf = 1/h
где, 1- это расстояние от старта к центру пятна,
h- расстояние от старта к финишу ( расстояние, которое прошел
растворитель).
На основе полученных данных делают вывод, хроматограму подклевывают к
протоколу.
Rf аминокислот (для фенола):
Аспарагиновая к-та |
– 0,07 |
Аргинин |
– 0,41 |
Глутаминовая к-та |
– 0,16 |
Тирозин |
– 0,52 |
Цистеин |
– 0,19 |
Аланин |
– 0,55 |
Глицин (гликокол) |
– 0,30 |
Фенилаланин |
– 0,78 |
Метионин |
– 0,39 |
Лейцин |
– 0,79 |
2. Определение активности аминотрансфераз.
Принцип метода. Аминотрансферазы – ферменты которые содержат в качестве коферментов фосфопиридоксамин, катализируют обратный перенос аминогрупп с α-аминокислот на α-кетокислоты. Определение концентраци α-кетокислот, которые образуются при трансаминирование лежит в основе динитрофенилгидразинового
метода определения активности трансаминаз.
Ход работы. Определение аспартатаминотрансферазы (АсАТ). В пробирку вносят 0,5 мл субстратно-буферной смеси для определения АсАТ, выдерживают в термостате при t =37оС в течении 5 минут, добавляют 0,1 мл сыворотки и инкубируют при t =37оС 60 минут. Потом добавляют 0,5 мл раствора
динитрофенилгидразина и выдерживают в течении 20 минут при комнатной
температуре. Добавляют 5 мл 0,4 М раствору NaOH, перемешивают и оставляют на 10 минут.
Измеряют оптическую плотность проб, которая исследуются при λ = 560 нм.
Определение активности аланинаминотрансферазы (АлАТ). В пробирку вносят 0,5 мл субстратно-буферной смеси для определения АлАТ, выдерживают в термостате при t =37оС в течении 5 минут, добавляют 0,1 мл сыворотки и инкубируют
при t =37оС 30 минут. Потом добавляют 0,5 мл раствора динитрофенилгидрозина и выдерживают в течении 20 минут при комнатной температуре. Добавляют 5 мл 0,4 М
раствору NaOH, перемешивают и оставляют на 10 минут. Измеряют оптическую плотность проб, которые исследуются. Контрольные пробы обрабатывают так, как опытные, но сыворотку добавляют после инкубации проб.
Расчет активности ферментов проводят по калибровочному графику. При
построении калибровочного графика на оси ординат откладывают значения
оптической плотности, а на оси абсцисс содержание ПВК.
Физиологические уровни: для АсАТ – 0,1-0,5, для АлАТ – 0,1-0,7 мкмоль ПВК на 1 мл сыворотки за 1 час инкубации при t =37оС.
48