4)По кислотоустойчивости антимикробные препараты классифицируются на:

*кислотоустойчивые – могут применяться перорально, например, феноксиметилпенициллин,

*кислотонеустойчивые – предназначены только для парентерального применения, например, бензилпенициллин.

Способы получения:

Источники:

-плесневые грибы (синтезируют природные бета-лактамы) и фузидиевую кислоту

-актиномицеты (особенно стрептомицеты) - ветвящиеся бактерии, синтезируют большое число природных антибиотиков (80%)

-типичные бактерии (бациллы, псевдомонады) - продуцируют бацитрацин, полимиксины

Основные способы получения:

-биологический синтез (для получения природных а/б). В условиях специализированных производств культивируют микробы-продуценты, которые выделяют а/б в процессе своей жиз-ти

-биосинтез с последующими химическими модификациями (при создании полусинтетических а/б). Сначала путём биосинтеза получают природный а/б, затем молекулы изменяют химической модификацией, присоединяют определенные радикалы, в результате чего улучшаются актимикробные и фармакологические свойства

-химический синтез (для получения чинетических аналогов природных а/б). Синтезированы химически.

5. Бактериологический метод диагностики. Требования к выращиванию бактерий в искусственных условиях.

Бактериологическое исследование — исследование, предназначенное для выделения бактерий и изучения их свойств с целью постановки микробиологического диагноза.

Бактериологический (культуральный) метод - совокупность методик искусственного культивирования микроорганизмов на питательных средах в целях их идентификации при установлении диагноза инфекционного заболевания или иного вызванного микробами процесса и определения ряда физиологических свойств культуры с другими целями, например, при выборе химиотерапевтического препарата.

Задачи:

· Первой задачей бактериологического метода является получение чистой культуры какого-либо вида (вара) из микробной ассоциации и предупреждение контаминации посторонней микрофлорой материала для исследования и микробной культуры на всех этапах исследования.

· Второй задачей - идентификация микробов выделенной чистой культуры, третья - определение дополнительных свойств, например, чувствительности к антибиотикам, вирулентности.

Этапы бактериологического метода:

1.Забор материала и его доставка в бактериологическую лабораторию;

2.Микроскопия исследуемого материала. Этот этап часто не выполняется, хотя, несмотря на меньшую чувствительность, предварительная микроскопия в ряде случаев дает ориентировочные сведения о возбудителе и позволяет выбрать необходимые для посева среды;

3.Обработка исследуемого материала физическими или химическими факторами в целях удаления или уменьшения посторонней микрофлоры. Эта мера применяется, при исследовании мокроты, выделении кислотоустойчивых и спорообразующих микробов;

4.Посев исследуемого материала на питательные среды для получения изолированных колоний;

5.Инкубация засеянных питательных сред. Сроки и температура инкубации зависят от предполагаемой видовой принадлежности культуры. Обычно посевы выдерживают в термостате при

37°С 1 -2 дня;

6.Исследование колоний. Для изучения выбирают однородные изолированные колонии, располагающиеся далеко от краев чашки и по штриху петли, окружают их чертой, нумеруют. Если исследование ведется ненаправленно, то на основании результатов визуального осмотра выбирают по

2- 3 колонии всех имеющихся на чашке типов и делают с них мазки;

7.Пересев с выбранных колоний на среды накопления. Для этого с остатка колонии, в мазке культурой выявлены однородные по форме и окраске бактерии, петлей, стараясь не задеть соседние колонии, забирают часть культуры и засевают на скошенный в пробирке МПА или специальную среду штрихом;

8.Инкубация посевов в термостате до появления сплошного роста (обычно 1 -2 дня);

9.Определение чистоты выросшей на скошенных средах культуры путем макроскопического осмотра роста и микроскопии мазка из него;

10.Идентификация выделенной чистой культуры и в случае необходимости определение различных биологических свойств;

11.Заключение о видовой принадлежности выделенной культуры и ее свойствах. Заключение дается на официальном бланке со ссылкой на номер, под которым эта культура занесена в лабораторный журнал.

Требования к выращиванию бактерий в искусственных условиях.

Культивирование бактерий в системах in vitro осуществляется на питательных средах. Искусственные питательные среды должны отвечать определенным требованиям и содержать воду, так как все процессы жизнедеятельности бактерий протекают в воде.

• Для культивирования гетероорганотрофных бактерий в среде должен содержаться органический источник углерода и энергии. Эту функцию выполняют различные органические соединения: углеводы, аминокислоты, органические кислоты, липиды. Наибольшим энергетическим потенциалом обладает

глюкоза, так как она непосредственно подвергается расщеплению с образованием АТФ и ингредиентов для биосинтетических путей.

•Для синтеза белков, нуклеотидов, АТФ, коферментов бактериям требуются источники азота, серы, фосфаты и другие минеральные вещества, в том числе микроэлементы. Источником азота может служить пептон; пептон продукт неполного гидролиза белков, состоящий из поли-, олиго- и дипептидов. Пептон также поставляет аминокислоты для построения бактериальных белков. кроме того, большинство бактерий способны использовать соли аммония в качестве источника азота. Серу и фосфор бактерии способны утилизировать в виде неорганических солей: сульфатов и фосфатов. Для нормального функционирования ферментов бактериям требуются ионы Са2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, которые добавляют в питательную среду в виде солей, чаще всего фосфатов.

•Решающее значение для роста многих микроорганизмов имеет рН среды. Поддерживание определенного рН имеет значение для предотвращения гибели микроорганизмов от ими же образованных продуктов обмена.

•Среда должна обладать определенным осмотическим давлением. Большинство бактерий способны расти на изотоничных средах, изотоничность которых достигается добавлением NaCl в концентрации 0,85%. Некоторые бактерии не способны расти на средах при концентрации соли в них ниже 1%. Такие бактерии называются галофильными. Так как устойчивость к осмотическому давлению определяется наличием у бактерий клеточной стенки, бактерии, лишенные клеточной стенки, микоплазмы L-формы, могут расти на питательных средах, содержащих гипертонический раствор, обычно сахарозы. При необходимости к питательной среде добавляют факторы роста, ингибиторы роста определенных бактерий, субстраты для действия ферментов, индикаторы.

•Питательные среды должны быть стерильными.

6. Бактериоскопический метод диагностики, его задачи и возможности. Методы микроскопии и их применение.

Бактериоскопический метод заключается в непосредственном определении исследуемых микроорганизмов в приготовленных препаратах, нативных или окрашенных, при помощи различных видов микроскопической техники: световой, темнопольной, иммерсионной, люминесцентной, фазово-контрастной, электронной микроскопии. Основной задачей микроскопии является идентификация м/о путем изучения его морфологических и тинкториальных свойств. Морфологические свойства характеризуются формой и размером клеток, а тинкториальные свойства – отношением микроорганизмов к красителям. Методы микроскопии, как было указано выше, достаточно разнообразны.

Иммерсионная микроскопия применяет жидкостную среду с большим коэффициентом преломления между исследуемым объектом и объективом, тем самым чудесным (нет) образом увеличивается разрешающая способность микроскопа. Разрешающая способность сама по себе складывается 3 показателей и является отношением длины волны к произведению показателя преломления среды и половины синуса угла, образуемого крайними лучами, попадающих в объектив (т.н. отверстный угол).

Темнопольная микроскопия использует подсвечивание объектов отраженным светом, отчего фон становится темным. Важным условием является использование нативных препаратов, при этом могут быть обнаружены микроорганизмы, чьи размеры меньше разрешающей способности микроскопа, однако их структуру изучить не удастся. Используется специальный темнопольный конденсор

Люминесцентная микроскопия основана на, как ни странно, люминесценции исследуемых объектов после обработки и под действием ультрафиолетового излучения. Таким образом можно изучать структуры клеток, выявлять отдельные молекулы, идентифицировать возбудителя (микобактерию туберкулеза). Необходим комплект отсекающего и возбуждающего фильтров

Фазово-контрастная микроскопия основана на преобразовании фазовых изменений света в амплитудные, видимые глазу. Используется фазовый кондесатор, кольцевые диафрагмы для отсечения света. Позволяет получать контрастные изображения прозрачных и бесцветных объектов.

Электронный микроскоп вместо видимого света использует пучок электронов, что гораздо повышает разрешающую способность такого микроскопа. Роль линз в данном случае играют электрические и магнитные поля, а контраст создается за счет разного рассеяния электронов.

7. Бактериофаги. Взаимодействие фага с бактериальной клеткой. Умеренные и вирулентные бактериофаги. Лизогения.

Бактериофаги (греч. phagos - пожирающий, лат. bacteriophaga - разрушающий бактерии)

– вирусы бактерий, обладающие способностью специфически проникать в бактериальные клетки, репродуцироваться в них и при выходе потомства вызывать в большинстве случаев разрушение (лизис) бактерий.

Британский бактериолог Эрнест Ханкин (1865-1939 гг.). Он отметил, что вода рек Индии обладает бактерицидными свойствами в отношении холерных вибрионов. При исследовании воды он выявил наличие в ней факторов, проникающих через бактериальный фильтр и вызывающих лизис возбудителя холеры.

Строение и химический состав бактериофагов

Типичная фаговая частица состоит из головки и хвостового отростка. Чем крупнее бактериофаги, тем больше у них генов и сложнее их жизненный цикл.

Большинство бактериофагов напоминают сперматозоиды (головастики, барабанные палочки).

При адсорбции бактериофага на клеточной стенке бактерии чехол сокращается, стержень проникает внутрь клетки и по нему нуклеиновая кислота впрыскивается в клетку.

Фаговая частица содержит 40-50% нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК), 50-60% белка, до 12-17% углеводов, 2% липидов. Бактериофаг является строгим внутриклеточным паразитом, так как он размножается только внутри бактериальной клетки.

Он не культивируется на искусственных питательных средах и в живых биологических системах (культуры клеток, куриные эмбрионы, лабораторные животные).

Основным признаком бактериофагов является специфичность. Специфичность бактериофагов выражается в том, что каждый бактериофаг способен лизировать только определенный вид бактерий.

Бактериофаги обладают выраженными антигенными свойствами. При парентеральном введении бактериофага в организме образуются антитела, нейтрализующие литическую (растворяющую) активность фага.

При этом действие антифаговых сывороток строго специфично. Кроме того, фаги по антигенным свойствам отличаются друг от друга. У некоторых родственных фагов обнаруживаются групповые антигены. По антигенным свойствам фаги подразделяют на серологические группы.

Для получения антифаговых сывороток используют кроликов, которых иммунизируют подкожно дважды в течение 3х недель. Сыворотку освобождают от форменных элементов центрифугированием.

Резистентность фагов

По сравнению с вирусами человека и животных бактериофаги более устойчивы к действию физических и химических факторов.

Бактериофаги хорошо переносят высушивание и замораживание, длительно сохраняются при низких температурах (минус 195°С), сохраняют активность в широком диапазоне рН

(2,5-8,5).

Большинство бактериофагов инактивируется при температуре выше 65-70°С. Ультрафиолетовое и ионизирующее излучения снижают адсорбционную способность фага и его патогенность.

Сулема (0,5% раствор), фенол (1-2% раствор), спирт, эфир и хлороформ не оказывают на фаги инактивирующего действия.

Губительно действует на бактериофаги 1% раствор формалина. Фаги быстро погибают при кипячении, действии кислот, ультрафиолетовых лучей, химических дезинфицирующих веществ.

На одной бактериальной клетке может адсорбироваться до 200-300 частиц фага.

Различают обратимую и необратимую фазы абсорбции.

Обратимая фаза характеризуется тем, что частицы фага после адсорбции возможно отделить от клетки путем энергичного встряхивания. Во время необратимой фазы адсорбции частицы фага не могут быть отделены от бактериальной клетки.

2. Проникновение нуклеиновой кислоты фага (инъекция, пенетрация) внутрь бактериальной клетки (рисунок 32).

После адсорбции происходит ферментативное расщепление клеточной стенки лизоцимом, находящимся в дистальной части фагового отростка.

Одновременно в сократительном чехле бактериофага высвобождаются ионы кальция, которые активируют АТФазу. В результате этого происходит сокращение чехла и вталкивание стержня хвостового отростка через цитоплазматическую мембрану внутрь клетки.

По каналу стержня ДНК фага впрыскивается в цитоплазму бактериальной клетки. При этом капсид и отросток остаются вне клетки. Около 10% фаговой ДНК активно впрыскивается внутрь клетки во время сокращения чехла, а остальная часть ДНК втягивается в цитоплазму бактерии благодаря процессам транскрипции и трансляции.

При адсорбции фагов на половых ворсинках проникновение нуклеиновой кислоты происходит по каналу F-пили.

3. Биосинтез компонентов фага внутри бактериальной клетки (рисунок 34).

Инъецированная нуклеиновая кислота вызывает перестройку метаболизма бактериальной клетки: прекращается синтез бактериальных нуклеиновых кислот и белков. В эту стадию ДНК бактериофага транскрибируется с помощью собственной транскриптазы и образуется иРНК, которая поступает на рибосомы клетки-хозяина, где синтезируются фаговые белки.

4. Сборка структурных компонентов фаговых частиц (рисунок 35).

Вновь синтезированные белки в цитоплазме клетки формируют капсиды, отростки и другие структуры дочерних фаговых частиц.

После этого синтезированная нуклеиновая кислота фагов заполняет пустотелые капсиды головок.

5. Сборка (морфогенез) зрелых фаговых частиц (рисунок 36).

Заполненный нуклеиновой кислотой капсид взаимодействует с хвостовой частью и образует зрелую фаговую частицу.

Соединение хвоста с головкой происходит только после полной их сборки. Точно так же ворсинки присоединяются к хвосту только после полного соединения отростка с головкой. Благодаря строгому генетическому контролю со стороны фага обеспечивается последовательность и согласованность всех процессов его внутриклеточного размножения.

После сборки в каждой бактериальной клетке накапливается до 200 фаговых частиц.

6. Выход фаговых частиц из клетки.

Вновь образованные фаговые частицы выходят наружу в результате лизиса клеточной оболочки изнутри фаговым лизоцимом.

Он синтезируется на последнем этапе размножения фага.

Некоторые нитевидные фаги высвобождаются из клетки путем прохождения нуклеиновой кислоты через цитоплазматическую мембрану и клеточную стенку бактерий. Вовремя такого прохождения фаги приобретают капсиды.

Такие циклы продолжаются до тех пор, пока не будут лизированы все чувствительные к фагу клетки.

ДНК умеренных фагов после проникновения в цитоплазму встраивается в геном бактериальной клетки. ДНК фага, встроенная в хромосому бактерии, называется профагом, а культура таких бактерий – лизогенной культурой (рисунок 39)

Совместное сосуществование бактерии и умеренного бактериофага называется лизогенией (от греч. lysis - разложение, genea – происхождение). Различают монолизогенность и полилизогенность.

Бактериальная культура, образующая после индукции один вид фага, называется монолизогенной, а бактериальная культура, образующая несколько видов фагов, называется полилизогенной.

ДНК умеренного фага встраивается в строго определенную область генома, синхронно с ним реплицируется и передается по наследству. При лизогении фагового потомства не образуется, так как в бактерии синтезируется специфический низкомолекулярный белок репрессор, подавляющий транскрипцию фаговых генов.

Биосинтез репрессора детерминируется генами профага. Лизогенные бактерии приобретают иммунитет (невосприимчивость) к последующему проникновению и размножению в них родственного фага.

У некоторых лизогенных культур спонтанно или под действием физических факторов и химических веществ (УФ-лучи, ионизирующее излучение, перекисные соединения, митомицин С и др.) профаг может исключаться из хромосомы и становиться литическим фагом. Этот процесс называется индукцией профага. Он заканчивается продукцией фагов и лизисом бактерий.

Лизогенизация бактерий может приводить к изменению их морфологических, культуральных, ферментативных, антигенных и биологических свойств. При этом профаг может придавать бактерии новые ранее отсутствовавшие у нее свойства.

Феномен изменения свойств микробов под влиянием профага называется фаговой конверсии (от лат. conversio-превращение). Например, профаг придает дифтерийной палочке способность продуцировать экзотоксин. Таким образом, различают следующие типы взаимодействия фагов с бактериями:

- продуктивный тип взаимодействия, при котором в клетке образуется фаговое потомство, обусловливающее лизис бактерий;