- интегративный тип взаимодействия, при котором нуклеиновая кислота фага встраивается в геном бактерии и сосуществует с ним в течение длительного времени.
Схема продуктивного и интегративного типов взаимодействия бактериофага и клетк представлена на рисунке 40.
По спектру литического действия выделяют следующие группы бактериофагов:
-типовые (типоспецифические) бактериофаги (Т-фаги) взаимодействуют с отдельными типами (вариантами) бактерий внутри одного вида;
-моновалентные бактерио фаги (монофаги) взаимодействуют с бактериями одного вида;
-поливалентные бактериофаги (полифаги) взаимодействуют с бактериями нескольких родственных видов.
По механизму взаимодействия с клетками бактериофаги подразделяются на вирулентные и умеренные.
-Вирулентные бактериофаги (литические бактериофаги) проникают в бактерии, размножаются в них и выходят из бактериальной клетки, вызывая ее лизис.
-Умеренные бактериофаги после проникновения в клетку встраивают свою нуклеиновую кислоту в геном бактерии и не вызывают ее лизиса
8. Бактериофаги. Получение, титрование. Практическое применение в диагностике, профилактике и лечение
Бактериофаги — вирусы бактерий, обладающие способностью специфически проникать в бактериальные клетки, репродуцироваться в них и вызывать их растворение (лизис).
Бактериофаг обладает всеми основными свойствами, присущими вирусам, а именно:
1) имеет элементарные частицы величиною в пределах от 20 до 200 нм;
2) содержит в своем составе нуклеиновую кислоту и белок;
3) не растет на искусственных питательных средах, размножаясь только внутри клеток микробов;
4) обладает высокой специфичностью в отношении поражаемой клетки;
5) имеет антигенную обособленность от клетки хозяина.
Получение бактериофага в настоящее время осуществляется в специальных аппаратах - реакторах, емкостью от 250 до 1000 л, с применением аэрации (как фактора, стимулирующего развитие микроорганизмов).
Для производства бактериофага берется его рабочая маточная раса и соответствующие культуры микробов.
1.В реактор наливается жидкая питательная среда, например, бульон Мартена или Хоттингера для изготовления брюшнотифозного и дизентерийного бактериофагов с рН 7,4-7,6 и стерилизуется при температуре 110 °С в течение 40 минут.
2.После стерилизации среда охлаждается до 39 °С и засеивается соответствующей микробной культурой и маточным бактериофагом одновременно. Для засева употребляются 18-часовые агаровые культуры, которые прибавляются из расчета 50 млн. микробных тел на 1 мл среды. Бактериофаг добавляется в количестве не более 0,3 % по отношению к объему питательной среды.
3.Среду с засеянными в ней культурой и бактериофагом оставляют при температуре 37 °С на 6-18 часов. Бактериофаги активно размножаются внутри бактериальных клеток, увеличиваясь в количестве и вызывая их лизис, что внешне проявляется полным просветлением среды.
4.К полученному лизату добавляется в качестве консерванта хинозол (0,01 %) или фенол (0,25 %) и не позже чем через 2 часа после этого содержимое реактора фильтруется через бактериальные фильтры (асбестовые пластины, свечи Шамбеолена или свечи ГИКИ соответствующей пористости) для удаления оставшихся микробных клеток.
5.Полученный препарат-бактериофаг должен иметь вид, совершенно прозрачной жидкости желтого цвета большей или меньшей интенсивности. Он проходит контроль на стерильность, безвредность и литическую активность, т.е. вирулентность.
Дополнительно:
Стерильность бактериофага проверяют обычным способом.
Безвредность препарата проверяют путем введения животным, например, брюшнотифозный и дизентерийный бактериофаги вводят подкожно трем мышам по 1 мл, либо внутривенно одному кролику 5 мл. Наблюдение за животными ведется в течение 3-4 суток; если препарат безвреден, они должны оставаться бодрыми и здоровыми.
Литическая активность бактериофага, его вирулентность определяются методом титрования на жидкой и плотной питательной среде.
Титрование бактериофага осуществляется по количеству активных корпускул фага, содержащихся в 1 мл исследуемого фильтрата и обеспечивающих лизис тест-культуры.
Титр выражают отрицательным логарифмом, в котором степень указывает на разведение фага (10 -4, 10 -7).
1.Титрование бактериофага по Аппельману:
-составить ряд из 8 сухих чистых пробирок;
-пипеткой налить в каждую из пробирок по 9 мл МПБ;
-в первую пробирку влить 1 мл фильтрата бактериофага (разведение 1:10 или 10-1) после чего 1 мл из нее перенести во вторую (разведение 10-2);
-процедуру повторять до 8 пробирки включительно. Из нее для уравнивания объемов 1 мл вылить в дез. раствор;
-8 пробирка - контроль с МПБ без бактериофага;
-в каждую пробирку ряда налить по 0,5 мл известной тест-культуры;
-поставить в термостат при +37 С на сутки;
-учесть результаты титрования.
2. Постановка реакции нарастания титра фага (РНТФ) осуществляется с известным бактериофагом и его титром. Бактериофаг вносится в анализируемый объем с предполагаемым инфектом. Через сутки контакта из объекта выделяют бактериофаг и определяют его титр. При отсутствии инфекции титр бактериофага падает, при наличии - растет, а РНТФ соответственно отрицательная и положительная.
Практическое применение бактериофагов:
1.Фагодиагностика (фагоиндикация) – выделение бактериофагов из организма больного и объектов внешней среды (косвенно свидетельствует о наличии в материале соответствующих бактерий).
2.Фагоидентификация – установления вида (фагодифференцировка) и типа (фаготипирование) бактерий (важно для эпидемиологического анализа заболевания – установление
источника и путей распространения заболевания).
3.Фагопрофилактика – применения бактериофагов с целью предупреждения заболеваний в эпидемическом очаге (например, дизентерийный, сальмонеллезный и стафилококковый бактериофаги).
4.Фаготерапия – применение бактериофагов с целью лечения инфекционных заболеваний (например, пиобактериофаг, брюшнотифозный и холерный бактериофаги).
5.Научные исследования.
6.Генная инженерия – использование бактериофагов в качестве векторов.
9. Вакцины Вакцинопрофилактика и вакцинотерапия
Термин ввёл Л. Пастер, первая вакцина – вирус коровьей оспы для иммунизации людей против натуральной оспы человека.
Вакцины используют не только для активной специфической профилактики инфекционных заболеваний, но и для профилактики и лечения неинфекционных и онкологических болезней, наркозависимости, табакокурения и др.
Вакцина - сложный ИБП, в состав котороговходят:
•специфических антигенов, стабилизаторы (гомологичные белки, такие как человеческий альбумин, сахарозо-агар-желатин и др.),
•консерванты (для подавления роста случайно попавших в препарат микроорганизмов применяют мертиолат, формалин и другие антимикробные препараты),
•адъюванты
o минеральные сорбенты: гели гидрата окиси и фосфата алюминии;
o полимеры, сложные химические соединения: ЛПС,мурамилдипептид;
o бактериальные клетки и ихкомпоненты: БЦЖ, коклюшные бактерии;
o липиды и эмульгаторы: ланолин, арлацел; вещества, вызывающие воспаление: сапонин, скипидар.
Свойства:
Действие на организм- в месте введения вызывают воспалительную реакцию с образованием фиброзной капсулы, что приводит к его депонированию и к пролонгированию действия. Активируют пролиферацию Т-, В- систем иммунитета, усиливают синтез защитных белков.
Действие на антигенукрепление его молекулы.
Вакцины применяют парентерально, внутримышечно, подкожно, чпескожно или интраназально, перорально.
Применение вакцинактивная иммунизация.
I.Живые вакцины
- основа – ослабленные, потерявшие вирулентность, но сохранившие специфическую антигенную активность штаммы патогенных микроорганизмов (бактерий, вирусов), - аттенуированных (ослабленные) штаммов. Аттенуация (ослабление) достигается путем длительного воздействия на штамм химических (мутагены), физических (температура, радиация) факторов или же длительного пассирования через организм невосприимчивых к инфекции животных или других биообъектов (эмбрионы птиц, культуры клеток).
Примером таких вакцин являются живые вакцины против кори, эпидемического паротита, краснухи, полиомиелита, гриппа.
- Кроме того, в качестве живых вакцин иногда используют так называемые дивергентные штаммы, т.е. непатогенные для человека микроорганизмы, имеющие общие протективные антигены с возбудителем инфекции.
Примерами дивергентных живых вакцин являются вакцина против натуральной оспы, в которой используется живой вирус оспы коров, и БЦЖ-вакцина, в состав которой включены родственные в антигенном отношении микобактерии бычьего типа.
В создании живых вакцин на основе генно-инженерных технологий также используют рекомбинантные штаммы бактерий или вирусов, в геном которых включены гены протективных антигенов патогенных микробов. Попадая в организм человека, эти штаммы при размножении синтезируют специфический антиген и, таким образом, создают иммунитет к возбудителю инфекции. Такие вакцины называются векторными. В качестве вектора используются некоторые поксвирусы, непатогенные штаммы сальмонелл и другие микроорганизм
II.Инактивированные (убитые) вакцины.
Для инактивации микроорганизмов обычно используют формальдегид, спирты, фенол, температурное и УФвоздействие, ионизирующую радиацию и другие физические или химические методы. Далее их выращивают на искусственных питательных средах или культурах клеток -> выделение и очистка антигенных комплексов -> добавление консервантов, иногда адъюванты.
Примером инактивированных вакцин являются вакцины против гриппа, неживая вакцина против полиомиелита, вакцина против бешенства.
III.Молекулярные вакцины.
-АГ в молекулярной форме или в виде фрагментов его молекулы (эпитопов).
Получение:
• биологическим синтезом в процессе культивирования микроорганизмов, либо при культивировании рскомбинантных бактерий или грибов, содержащих ген нужного антигена,
•химическим синтезом антигенных детерминант.
Молекулярные вакцины не распространены из-за низкой иммуногенетика АГ.
В медицинской практике широко применяется только одна рекомбинантная вакцина против гепатита В. При вакцинации этой вакциной препарат необходимо вводить трижды с короткими (месяц) промежутками для получения полноценного иммунного ответа.
Для повышения иммуногенности их сшивают с полимерными крупномолекулярными безвредными для организма соединениями, которые играют роль шлеппера и адъюванта.
Примером такой вакцины является отечественная вакцина против гриппа Гриппол.
IV. Анатоксины (токсоиды).
Принцип получения анатоксинов состоит в том, что образующийся при культивировании бактерий токсин в молекулярном виде превращают в нетоксическую, н о сохраняющую иммуногенность форму — анатоксин. Для этого токсин подвергают нагреванию до 37 °С и обработке 0,4% формалином в течении 3—4 нед, -> проверка препарата на токсичность, очищают от клеточных компонентов, продуктов бактерий и питательной среды и концентрируют. Для повышения иммуногенности добавляют адъюванты.
Примером таких вакцин служат дифтерийный, столбнячный, ботулинический, стафилококковый, холерный и гангренозный анатоксины.
V.Ассоциированные вакцины
Ассоциированными называются вакцины, в состав которых входит несколько разнородных антигенов, что позволяет проводить вакцинопрофилактику сразу нескольких инфекций. В состав таких вакцин могут входить как живые, так и убитые вакцины.
Если в состав препарата входят однородные компоненты, то такую вакцину называют поливакциной,например живая полиомиелитная вакцина, в состав которой входят аттенуированные штаммы вируса полиомиелита I, И и III типа.
Если препарат состоит из разнородных компонентов, его называют комбинированной вакциной. Примерами комбинированных вакцин являются живая ассоциированная вакцина против кори, эпидемического паротита и краснухи и АКДС-вакцшга (коклюш, дифтерия, столбняк).