43. Микологический метод диагностики микозов. Методы идентификации дрожжей и нитчатых грибов.
Микологический метод для идентификации чистой культуры (ЧК) и определения чувствительности к антифунгальным препаратам.
Выделение ЧК методами механического разобщения и культивирования на искусственных питательных средах.
Грибы растут медленнее бактерий (3 -5 дней). Образование колоний грибов на твердых питательных средах - результат апикального роста главной гифы и ее ответвлений.
Грибы обладают выраженной сахаролитической активностью, поэтому их выращивают на специальных средах, содержащих углеводы: l среда Сабуро, l сусло-агар, l морковный агар и другие, l а также среды с а/б. l l р. Н среды 4, 0 -6, 5.
Грибы растут в широком диапазоне температур (20 -45 °С).
Грибы, вызывающие заболевания человека, обычно культивируются при температуре +37 °С и +28 °С.
При росте многоклеточных грибов на питательных средах различают субстратный или погружной мицелий (врастающие колонии, большая часть в среде) и воздушный мицелий (большая часть его находится над питательной средой).
К методам идентификации дрожжей относят выявление морфологии клетки, определение способов формирования плодовых образований, способов сбраживания углеводов и утилизации азот- и углеродсодержащих соединений.
Фенотипическое описание дрожжей включает следующие этапы:
1)определение способа деления клеток. Выявление способов размножения (почкованием или делением клеток), определение морфологии клеток;
2)выявление наличия или отсутствия гифов и псевдогифов:
•выявление наличия или отсутствия половых образований;
•выявление способности сбраживать углеводы;
•определение способности к размножению на определенных углерод- и азотсодержащих, а также на других специфических культуральных средах.
Вегетативное размножение. Виды дрожжей родов Saccharomyces, Zygosaccharomyces
делятся путем мультилатерального почкования, тогда как Hamemaspora — путем биполярного почкования.
Базидиомицетам также свойственны разные типы почкования. Большинство из них размножается путем полярного почкования — либо на узком основании, либо вблизи полюсов. Некоторым базидиомицетам свойственно типичное мультилатеральное почкование, тогда как другим свойственно и почкование, и деление. При исследовании молодой (24—48 ч) быстро развивающейся культуры почкующиеся клетки легко распознаются. Клетки же, размножающиеся делением, вскоре образуют концентрическую колонию вокруг исходной, так что способ размножения в данном случае не очевиден.
Дрожжи рода Candida (синоним Torulopsis) идентифицируют по критерию образования псевдогифов, причем признается, что, хотя некоторые виды, классифицируемые как Torulopsis, образуют псевдогифы, мицелий такого типа образуют не все штаммы дрожжей рода Candida. Образование истинных гифов также может служить признаком, используемым для различения штаммов.
Половые образования. Половые образования нередко формируются перед конъюгацией, которая происходит или между отдельными клетками, или между клеткой и ее почкой. Если в качестве конъюгата выступает почка, то место соединения зачастую слегка удлиняется, и стенка почки под микроскопом может выглядеть тоньше. Виды, для которых характерна конъюгация между клеткой и ее почкой, почти всегда гомоталломны.
Неконъюгированные аски образуются как гомо-, так и гетероталломными диплоидными штаммами. Неспособность штаммов формировать половые образования может свидетельствовать об отсутствии необходимых условий или о принадлежности данной культуры к родственному типу.
Методы анализа на молекулярном уровне являются быстрым и точным средством идентификации видов микроорганизмов. Их можно использовать в том числе и для обнаружения новых видов ДВПП. Потребность в количественной оценке генетического сходства штаммов и видов на молекулярном уровне была удовлетворена, в частности, благодаря методике реассоциации или гибридизации ядерной ДНК. ДНК из двух представляющих интерес видов разделяют, смешивают и выделяют однонитевую последовательность, после чего степень сходства определяют по уровню реассоциации. Для измерения применяют различные способы: как спектрофотометрические, так и с помощью радиоизотопов или других маркеров. Результат измерения комплементарности ДНК обычно выражают процентом связанности, но он может вводить в заблуждение, так как цепочки ДНК перед дуплексированием должны иметь подобие базовых сегментов не менее 75—80%, а результаты должны соотноситься со шкалой сходства. Существенное влияние на образование двойной спирали ДНК оказывают условия эксперимента, однако при проведении измерений в оптимальных условиях различные методы оценки сходства ДНК дают практически одинаковый результат. Процент сходства ДНК позволяет примерно оценить общее подобие геномов двух микроорганизмов, однако данным методом невозможно обнаружить различия в одном гене или безошибочно определить плоидность, хотя в некоторых случаях может быть выявлена анеуплоидия.
44. Микоплазмы. Биологические свойства, особенности строения. Роль в патологии человека. Принципы диагностики и лечения
Микоплазмы — самые мелкие свободноживущие бактерии размером 0,3—0,8 мкм, не имеющие клеточной стенки и окруженные только цитоплазматической мембраной.
В настоящее время микоплазмы относятся к классу Mollicutes, который подразделяется на 1 порядка, 4 семейства, 6 родов и около 100 видов. Наибольшее значение имеет подсемейство Mycoplasmataceae, которое включает 1 рода — род Mycoplasma и род
Ureaplasma.
Болезни, вызываемые микоплазмами, называются микоплазмозами. В клинической практике выделяют микоплазмозы респираторные (М. pneumoniae — основной возбудитель респираторного микоплазмоза), урогенитальные (возбудители воспалительных заболеваний урогенитального тракта — М. hominis, M. genitalium, li urealyticum).
M. incognitos выделяется при генерализованном процессе, М. fermentas играет существенную роль в развитии клинических проявлений СПИДа. Микоплазмы являются мембранными паразитами, прикрепляясь к клетке хозяина, они могут длительное время размножаться и персистировать в макроорганизме, изменяя метаболизм инфицированных клеток.
Морфологические и тинкториальные свойства.
Микоплазмы — прокариотические микроорганизмы, имеющие лишь одну липопротеиновая мембрану, в которой содержатся стеролы. Мембрана выполняет функции и клеточной стенки, и цитоплазматической мембраны. Отсутствие клеточной стенки определяет полиморфизм, осмотическую чувствительность, способность проходить через бактериальные фильтры, а также нечувствительность к лекарственным веществам, подавляющим синтез клеточной стенки (пенициллинам и др.).
Микоплазмы могут иметь палочковидную, кокковидную, нитевидную, а также ветвящуюся форму.
По Граму окрашиваются отрицательно. Спор и капсул не образуют.
Культуральные свойства.
Микоплазмы — факультативные анаэробы. Температурный оптимум 37"С. Очень требовательны к питательным средам, растут на сложных средах, содержащих дрожжевой экстракт, а также экстракты сердца и мозговой ткани, сыворотку, стеролы, углеводы и др. Микоплазмы растут медленно. На плотных средах через несколько дней образуют мелкие круглые колонии с приподнятым центром, напоминающие яичницу-глазунью.
Возможно культивирование на клеточных культурах и куриных эмбрионах. Рост ингибируется специфическими иммунными сыворотками. Биохимическая активность у микоплазм низкая, некоторые виды способны ферментировать углеводы с образованием кислоты.
Факторы патогенности микоплазм весьма разнообразны. К ним относятся сложно устроенные полярные адгезиновые комплексы (белок Р1). Образование перекиси водорода и перекисных радикалов сопровождается повреждением мембраны клетки хозяина, что вызывает тесное слияние мембран при прикреплении микоплазм. При этом происходит подавление защитной функции мерцательного эпителия. Выделение эндотоксина,
гемолизинов, а также секреция ферментов (фосфолипаза, АТФаза, протеаза, нуклеаза) вызывают локальные клеточные разрушения.
Также у микоплазм есть капсулоподобная оболочка, повышающая прочность микроба и придающая им иммуносупрессорную активность.
Антигенная структура.
Антигенами являются мембранные белки, а также гликолипиды и полисахариды. По антигенной структуре микоплазмы разделяются на виды.
Экология и резистентность.
Микоплазмы широко распространены в природе, могут находиться в почве, стоячей воде, паразитировать в организме животных и растений. Устойчивость во внешней среде относительно невысока. Микоплазмы чувствительны к нагреванию, а также к воздействию антисептиков и дезинфектантов в обычных концентрациях.
Роль в патологии человека.
Возбудители респираторных микоплазмозов М. pneumoniae, а также М. hominis —
возбудители антропонозной респираторной инфекции, при которой могут наблюдаться поражения верхних дыхательных путей, а также глубоких отделов респираторного тракта.
Эпидемиология. Источник инфекции — больные в остром периоде заболевания или носители, перенесшие острую или бессимптомную инфекцию. Путь передачи воздушно-
капельный.
!Особенностями респираторного микоплазмоза являются относительно слабая контагиозность и высокая частота бессимптомных и легких форм инфекции.!
Патогенез и клиническая картина. Возбудитель поражает клетки реснитчатого эпителия. Респираторный микоплазмоз может протекать по типу инфекции верхних дыхательных путей (фарингига, трахеобронхита) или по типу пневмонии. Адгезия микоплазм к эпителиальным клеткам приводит к инвагинации клеточных мембран и делает находящиеся в них микоплазмы недоступными к воздействию антител, комплемента и других защитных факторов. Экзотоксин возбудителя оказывает токсическое действие на микроциркуляторное русло, нервную систему. Лихорадочный период длится до 4 нед, с умеренной интоксикацией, нередко больные переносят заболевание на ногах. Возможны гематогенная диссеминация в суставы, костный мозг, мозговые оболочки, а также развитие иммунопатологических процессов.
Иммунитет. После перенесенного заболевания формируется непродолжительный иммунитет.