Функциональная роль:

1. Участие фолдинг – при участии разных групп шаперонов, препятствующих

нежелательным взаимодействиям белков с другими молекулами клетками, происходит синтез и фолдинге белков.

2. Шапероны защищают белки от денатурации и способны восстанавливать нативную конформацию белков.

7.Физико-химические свойства белков: амфотерные, буферные, коллоидные, осмотические. Высаливание. Денатурация. Свойства денатурированного белка. Ренатурация.

Физико-химические свойства белков:

А) Амфотерные

Белки являются амфотерными полиэлектролитами. Природа групп, придающих такие свойства, отличается от таковых у аминокислот.

Если у аминокислот свойства обусловлены наличием альфа-амино- и альфа-

карбоксильной групп, то у белков эти группы образуют пептидные связи, а свойства придают кислотно-основные группы боковых радикалов аминокислот.

Кислотные свойства белку придают: аспарагиновая, глутаминовая, аминолимоннная кислоты.

Основные свойства придают: лизин, аргинин, гистидин.

Б) Буферные

Эти свойства обеспечивают поддержание постоянного рН в организме. Белки являются преимущественно слабыми буферами. Наличие буферных свойств обусловлено содержанием гистидина в белке. В гемоглобине его содержание достигает около 8% от всех аминокислот, поэтому гемоглобин является мощным буфером крови.

В) Коллоидные

Белковые растворы можно было бы отнести к истинным растворам, но они имеют большую молекулярную массу, что и придает им признаки коллоидов:

1. Оптические свойства: растворы белков обладают опалесценцией (способны рассеивать свет), при боковом освещении раствора белка наблюдается эффект Тиндаля – лучи

проходящего через раствор света становятся видимыми, и образуют полосу или конус, расширяющийся от источника света.

2. Малая скорость диффузии: по сравнению с растворами ионов, низкомолекулярных соединений скорость диффузии в тысячи раз меньше. Скорость диффузии фибриллярных белков меньше, чем глобулярных.

3. Неспособность проникать через мембраны: это свойство обусловлено высокой молекулярной массой белков и используется в диализе – процессе очистки растворов белков от низкомолекулярных соединений, проходящих через полупроницаемую

мембрану.

4. Высокая вязкость: обусловлена большой молекулярной массой; растворы фибриллярных белков обладают большей вязкостью, чем р-ры глобулярных.

Воздействие различных химических, физических факторов влияет на вязкость. Так:

А) Добавление солей кальция в раствор повышает вязкость раствора из-за формирования кальциевых мостиков в белке.

Б) Нагревание раствора белка снижает вязкость.

5. Способность образовывать гели: при увеличении вязкости возможно образование геля (он же студень), который представляет собой совокупность структурных сеток,

заполненных молекулами воды.

Г) Осмотические свойства

Из-за неспособности белков диффундировать через мембраны возникает осмос, т.е.

перемещение молекул воды через мембрану в раствор белка. Перемещение происходит до того момента, пока давление раствора белка не станет равным осмотическому давлению, то есть, такому давлению, при котором ток молекул воды в раствор белка

прекращается.

Высаливание – это добавление растворов нейтральных солей (Na2SO4, (NH4)2SO4).

Анионы (SO4 2–) и катионы (Na+ , NH4 +) взаимодействуют с зарядами белка (группы NH4

+ и COO– ). В результате заряд исчезает, и соответственно, исчезает взаимоотталкивание молекул. Одновременно резко уменьшается гидратная оболочка. Это ведет к "слипанию" молекул и осаждению. Характерная особенность белков, полученных высаливанием – сохранение ими нативных свойств после удаление соли.

Денатурация – необратимое осаждение белка из-за разрыва связей, стабилизирующих четвертичную, третичную, вторичную структуры белка, сопровождаемое изменением растворимости, вязкости, химической активности, снижением или полной потерей

биологической функции.

1. Физическая денатурация – повышение температуры, ультрафиолетовое и

микроволновое излучение, механические воздействия, ионизация заряженными частицами.

2. Химическая: кислоты и щелочи образуют водородные связи с пептидными группами, органические растворители образуют водородные связи и вызывают дегидратацию, алкалоиды образуют связи с полярными группами и разрывают систему водородных и ионных связей, тяжелые металлы взаимодействуют с заряженными радикалами,

нейтрализуют отрицательные заряды и разрывают систему водородных и ионных связей.

Свойства денатурированных белков: наиболее типичными для денатурированного белка являются следующие признаки:

1. Увеличение числа реактивных или функциональных групп по сравнению с нативной молекулой белка. Часть этих групп обычно находится внутри молекулы белка и не выявляются специальными реагентами. Рзавертывание полипептидной цепи при денатурации позволяет обнаружить эти дополнительные, или скрытые группы.

2. Уменьшение растворимости и осаждение белка (связано с потерей гидратной

оболочки, развертыванием молекулы белка с «обнажением» гидрофобных радикалов и нейтрализацией зарядов полярных групп).

3. Изменение конфигурации молекулы белка.

4. Потеря биологической активности, вызванная нарушением нативной структурной организации молекулы.

5. Более легкое расщепление протеолитическими ферментами по сравнению с нативным белком – переход компактной нативной структуры в развернутую рыхлую форму

облегчает доступ ферментов к пептидным связям белка, которые они разрушают.

Ренатурация: восстановление физико-химических и биологических свойств белка называется ренативация (ренатурация) Иногда для ренативации достаточно просто удалить денатурирующий объект. При восстановлении исходной структуры белка возвращаются и его биологическая активность.

8. Методы выделения индивидуальных белков, основанные на их физико-химических свойствах: методы разрушения тканей, методы очистки белков (электрофорез,

хроматография и др.)

1) Методы разрушения:

А) Гомогенизация биологического материала:

Суть метода: ткань, находящуюся в буферном р-ре с определенным значением рН и концентрацией солей помещают в стеклянный сосуд (гомогенизатор) с пестиком. Пестик измельчает и растирает ткань о стенки сосуда.

Б) Метод замораживания и оттаивания ткани:

В результате попеременного замораживания/оттаивания кристаллы льда разрушают оболочки клеток. После этого нерастворимые части осаждают центрифугированием. Затем центрифугируют гомогенат и получают отдельные фракции, срдержащие ядра, митохондрии и другие органеллы, а также надосадочную жидкость, в которой и будет содержаться среди других фракций искомый белок.

В) Экстракция белков, связанных с мембранами, разрушение олигомерных белков на протомеры:

Для разрушения связей между белками и другими структурами клетки (например, липидами) добавляют детергент (денатуративный агент) в раствор, чаще всего тритон Х- 100 или додецилсульфат натрия.

Г) Удаление из раствора небелковых веществ:

Используя физико-химические свойства нуклеиновых кислот, липидов и прочих веществ, можно удалить их из раствора. Так:

1. Нуклеиновые кислоты легко удаляются добавлением стрептомицина

2. Липиды легко удаляются добавлением ацетона

2. Методы очистки белков (очистка от других белков)

А) Очистка белков избирательной денатурацией:

С помощью денатурации можно осадить ненужные белки, еще искомый белок выдерживает условия денатурации. После этого осадок отфильтровывают или центрифугируют (осаждают с помощью центрифуги).

Б) Высаливание:

Похож на предыдущий, но используют соли щелочных и щелочно-земельных металлов

(чаще всего (NH4)2SO4). Чем выше растворимость белка, тем большая концентрация соли необходима для его высаливания.

2. Гель-фильтрация (метод молекулярных сил)

Основан на том, что вещества с разной молекулярной массой по-разному распределяются между подвижной и неподвижной фазами.

Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества (сефадекс, агароза). Неподвижная фаза – жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой.

Смесь белков элюируют (вымывают) через колонку растворителем. Мелкие молекулы задерживаются в порах, крупные молекулы вымываются из колонки.

Сейчас гели, ввиду их легкой деформации под давлением, заменяют жесткими матрицами (сефантил, тойоперл).