36. Определение групп крови по системе ав0 с помощью стандартных эритроцитов и моноклональных антител (оснащение, техника, учёт результатов).

Определение группы крови с помощью стандартных эритроцитов (перекрёстный метод). Данная методика является как бы зеркальным отражением описанной выше и используется в основном в серологических лабораториях. Необходимое для данной процедуры оснащение включает в себя набор стандартных эритроцитов, сыворотку крови обследуемого пациента (её получают отстаиванием или центрифугированием крови), эмалированный планшет, иглы, пипетки, стеклянные палочки. Условия и техника постановки реакции почти не отличаются от таковых при использовании стандартных сывороток. Разница в том, что на планшет наносится исследуемая сыворотка, в которую добавляют стандартные эритроциты и нет необходимости ставить реакцию в двух сериях.

О групповой принадлежности крови пациента судят по комбинации лунок, в которых произошла агглютинация.

0(I) – агглютинация в лунках с эритроцитами II и III групп.

A(II) – агглютинация в лунке с эритроцитами III группы.

B(III) – агглютинация в лунке с эритроцитами II групп.

AB(IV) – агглютинации нет нигде.

Следует отметить, что в лунке со стандартными эритроцитами I группы агглютинации не бывает, так как в этих эритроцитах нет антигенов. Их использование – мера контроля специфичности реакции.

Определение группы крови с помощью моноклональных антител. Моноклональные антитела (цоликлоны) ‒ это иммуноглобулины класса M, продуцируемые гибридомой – клеткой, искусственно полученной в результате слияния В-лимфоцита и клетки мышиной миеломы. Взаимодействуя с агглютиногенами, цоликлоны анти-А и анти-В вызывают более быструю и выраженную реакцию агглютинации, чем при взаимодействии агглютининов. Постановка реакции и учёт её результатов проще, чем при использовании стандартных сывороток. Поэтому использование моноклональных антител – более современный и предпочтительный способ определения групповой принадлежности крови.

Необходимое для данной процедуры оснащение включает в себя цоликлоны анти-А, анти-В, анти-АВ, исследуемую кровь, эмалированный планшет, иглы, пипетки, стеклянные палочки. Реакцию проводят в помещении с хорошим освещением при температуре 15-25°С.

В лунки планшета наносится по одной капле объёмом 0,1 мл цоликлонов анти-А, анти-В и анти-АВ. В каждую каплю цоликлона вносится по 0,01 мл исследуемой крови, производится осторожное перемешивание стеклянными палочками. Через 3 минуты в каждую лунку добавляется по капле физиологического раствора и производится учёт результатов. При положительной реакции в лунке видны красные зернышки, состоящие из склеенных эритроцитов. При отрицательной реакции капля остаётся равномерно окрашенной в красный цвет.

О групповой принадлежности крови пациента судят по комбинации лунок, в которых произошла агглютинация.

0(I) – агглютинации нет нигде.

A(II) – агглютинация в лунке с цоликлонами анти-А и анти-АВ.

B(III) – агглютинация в лунке с цоликлонами анти-В и анти-АВ.

AB(IV) – агглютинация во всех трёх лунках. В данном случае для окончательного вывода в четвёртую лунку планшета капают физиологический раствор и добавляют кровь пациента. Агглютинации быть не должно. Это контроль специфичности реакции.

37. Определение резус-принадлежности пациента с помощью антирезусной сыворотки, моноклональных антител (оснащение, техника, учёт результатов). Понятие о резус-конфликте, типичные ситуации его возникновения, последствия.

Определение резус-принадлежности с помощью антирезусной сыворотки. Данная методика основана на взаимодействии между эритроцитами пациента и антирезусной сывороткой, содержащей антитела к резус-фактору. Источником этой сыворотки является кровь сенсибилизированного донора.

Указанная реакция имеет ряд особенностей. Во-первых, для исключения агглютинации из-за взаимодействия по системе АВ0 необходимо использовать антирезусную сыворотку АВ(IV) группы, не содержащую в себе агглютинины. Во-вторых, поскольку реакция взаимодействия между резус-фактором и антителами к нему протекает достаточно тяжело, для неё необходимо создавать особые условия: либо подогревание в виде термостатирования на водяной бане, либо использование веществ (33% раствор полиглюкина, 10% раствор желатина), создающих среду, облегчающую течение реакции. В противном случае взаимодействие просто не произойдёт.

Технически реакция может проводиться несколькими способами.

1. Лабораторный метод. На чашку Петри по горизонтали наносится три капли (по 0,1 мл) антирезусной сыворотки одной серии, под ними во второй горизонтальный ряд – три капли антирезусной сыворотки другой серии. В обе капли первого вертикального ряда вносится по 0,01 мл исследуемой крови, второго вертикального ряда – по 0,01 мл стандартных резус-положительных эритроцитов (это мера контроля активности сыворотки), третьего ‒ по 0,01 мл стандартных резус-отрицательных эритроцитов (контроль специфичности реакции). Чашку Петри закрывают и ставят на водяную баню при температуре 46-48°С. Через 10 минут учитывают результат реакции:

Резус положительный – агглютинация в первом и втором вертикальных рядах, в третьем – нет.

Резус отрицательный – агглютинация во втором вертикальном ряду, в первом и третьем – нет.

2. Экспресс-метод. В центрифужную пробирку вносится капля стандартного универсального реагента (антирезусная сыворотка АВ(IV) группы, разведённая в 33% растворе полиглюкина). Добавляется капля исследуемой крови и содержимое пробирки плавными вращательными движениями размазывается по её стенкам. Через 3 минуты учитываются результаты. Наличие агглютинации свидетельствует о положительном резусе исследуемой крови, отсутствие агглютинации – об отрицательном.

Определение резус-принадлежности с помощью моноклональных антител. Необходимое для данной процедуры оснащение включает в себя цоликлон анти-D, исследуемую кровь, эмалированный планшет, иглы, пипетки, стеклянные палочки. Реакцию проводят в помещении с хорошим освещением при температуре 15-25°С.

В лунку планшета наносится капля объёмом 0,1 мл цоликлона анти-D и добавляется 0,01 мл исследуемой крови, производится осторожное перемешивание стеклянными палочками. Через 3 минуты производится учёт результатов. При положительной реакции в лунке в виде образования красных зернышек кровь пациента резус-положительна, при отрицательной реакции (капля остаётся равномерно окрашенной в красный цвет) – кровь резус-отрицательна.

Система резус-фактора включает в себя 50 различных эритроцитарных антигенов, из которых учитывается только наиболее иммуногенный – антиген D. Если на мембране эритроцитов человека есть антиген D, он считается резус-положительным (85% населения), если нет – резус-отрицательным (15% населения). В организме человека в норме антитела к резус-фактору отсутствуют. Они появляются только в случае, если резус-отрицательный человек был сенсебилизирован, то есть получил контакт с антигеном D. Такая ситуация лежит в основе развития резус-конфликта. Возможны три варианта его возникновения.

1. Переливание резус-отрицательному человеку резус-положительной крови. При этом происходит сенсебилизация организма, но гемолиза не будет, так как ещё отсутствуют необходимые для этого антитела. Гемотрансфузионные осложнения возникнут только при повторном переливании ранее сенсебилизированному человеку резус-несовместимой крови.

2. Беременность резус-отрицательной женщины резус-положительным плодом. Первая такая беременность обычно протекает без особенностей. При родах кровь плода попадает в кровь матери и сенсебилизирует её организм. При повторной беременности накопившиеся антитела проникают через гематоплацентарный барьер и разрушают эритроциты плода, вызывая гемолитическую болезнь новорожденных. Каждая последующая беременность протекает тяжелее предыдущей (из-за увеличения титра антител), становятся возможными выкидыши, внутриутробная гибель плода. Для уменьшения вероятности резус изоиммунизации матери вводится антирезусный иммуноглобулин.

3. Целенаправленная сенсебилизация резус-отрицательных добровольцев для получения из их крови антирезусной сыворотки.